La protéomique d’expression différentielle

Actuellement responsable d’un laboratoire à l’Université de Californie L’analyse différentielle consiste à comparer au travers de la présence des molécules biologiques, deux situations. Ceci est réalisé quotidiennement dans les LAM : détection d’un syndrome d’inflammation révélé par la présence de la protéine CRP. Si on cherche à comprendre l’amplitude et l’évolution du syndrome, il est nécessaire de corréler la concentration sérique de la CRP avec celles de l’orosomucoïde et de l’haptoglobine. Pour découvrir sans a priori de nouvelles molécules d’intérêt Transcriptome : évènements post-traductionnels pas vus et les aspects cinétiques au niveau des protéines pas considérés Protéome : la méthode la plus utilisée actuellement : la 2D-PAGE Une nouvelle méthode : l’ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) John YATES Actuellement responsable d’un laboratoire au Scripps Research Institute La Jolla en californie Patrick O’FARRELL 1970 Actuellement responsable d’un laboratoire à l’Université de Californie

La protéomique d’expression différentielle par gel 2D Deux conditions (ex : cancer – pas cancer, traitée-non traitée) Les protéines modifiées entre deux situations cellulaires distinctes doivent être effectivement détectables sur gels 2D et à un taux permettant leur identification Les variations détectées devront être répétitives et statistiquement validées

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D Sur un gel le rapport d’intensité entre le plus petit et le plus gros spot est de 104 Dans une cellule la dynamique d’expression est au moins de 105 voire de 106 Les protéines impliquées dans la transduction de signaux sont rarement mises en évidence sur les gels 2D (100 à 1000 protéines par cellule). Or ces protéines assurent des fonctions très importantes en terme de régulation. Il faut donc utiliser des moyens qui permettent de faire des tris sélectifs de molécule. Tri par différences de solubilité Pas la cellule entière mais seulement un des compartiments ou organites : noyau, cytoplasme, mitochondrie Extraction sans détergent va favoriser l’extraction des protéines cytoplasmiques L’utilisation de solutions ayant un pouvoir d’extraction croissant va favoriser la solubilisation des protéines hydrophobes

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D Pré-fractionnement des extraits par chromatographie et méthodes dérivées Sans a priori Fractionnement de l’extrait protéique selon un critère physico-chimique (charge, hydrophophilie,…). Toutes les fractions sont ensuite analysées par 2D. Avec a priori Sélection d’une famille de protéines : phosphoprotéome, glycoprotéome Anti-phosphotyrosine

Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D Pré-fractionnement des extraits par isoélectrofocalisation Rotofor®

Deux approches d’analyse différentielle des gels 2D Comparaison statistique entre plusieurs gels DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis

Acquisition des images Gel 2D Données numériques x Les pixels ont une valeur de densité optique (DO) proportionnelle à l’intensité du signal enregistré Dans un gel le rapport de DO entre le plus petit spot et le plus gros est de 104 y Méthode de détection Sensible Linéaire

Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdal Métaux lourd Méthode de détection Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdal Métaux lourd Sonde fluorescente µg 0,2 ng Gamme étroite 2 ng Instrumentation de digitalisation Tube photosensible + scanner (lampe fluorescente ou faisceau laser) Trans-illuminateur à décharge gazeuse + caméra CCD refroidie Écran phosphorescent Typhoon PhosphorImager

Système d’exploitation non programmable Les logiciels d’analyse d’image Système d’exploitation non programmable Année 70 : Gellab, Tycho, Lips ou Elsie Année 80 : Quest, Mélanie et Kepler Unix Année 90 : Mélanie II, PDQuest, Phoretix 2D Windows 95 ou NT Aujourd’hui : Progenesis développé par NonLinear Dynamics Newcastle Mélanie 4 developpé par SIB à Genève Windows XP

Progenesis ≈ 80 000 €

Mélanie Version gratuite sans la 3D

Analyse par correspondance Analyse statistique Une analyse différentielle fiable nécessite une comparaison entre des séries d’au moins trois à quatre gels Outils statistiques Analyse heuristique Analyse par correspondance Détermination de la dispersion entre les gels des différentes séries NT

Les protéines cytoplasmique des cellules humaines du lymphome de Burkitt antiIgM 951 spots Lymphome malin non différencié, retrouvé en Afrique centrale mais également dans d'autres régions du monde. La principale manisfestation est une grande lésion ostéolytique de la mâchoire inférieure ou une masse abdominale. Michel CARON Paris 2002

Analyse protéomique du carcinome hépatocellulaire Jean Rosenbaum Bordeaux 2002

Nicotinamide N-methyltransferase Ig Kappa Chain V Tissu non tumoral Nicotinamide N-methyltransferase Ig Kappa Chain V CHC Reproductibilité des gels d’electrophorèse 2D: gels résultant de 4 expériences indépendantes réalisées sur le même échantillon

Diminution de la formininotransferase cyclodesaminase dans les CHC Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4 Tissu non tumoral CHC Diminution de la formininotransferase cyclodesaminase dans les CHC

Clusterisation hiérarchique Cas 1 2 3 4 Clusterisation hiérarchique

Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral Cas 1 2 3 4 Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral

Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral Cas 1 2 3 4 Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral

DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis

N-hydroxy-succinimidyl ester : réaction de substitution nucléophile avec le groupe amine en e des lysines pour former une amide

Differential 2D-Gel Electrophoresis (DIGE)

Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers

Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers DIGE gel images of normal and cancer cells Cy3 image of proteins from normal cells Cy5 image of proteins from tumor cells SYPRO Ruby-stained gel image

Effects of Culture on Abundance of Myocyte Proteins

iTRAQ™ développé par Applied Biosystem The iTRAQ™ reagents consist of a charged reporter group, a peptide reactive group and a neutral balance group. The peptide reactive group reacts with primary amines and labels all peptides. An increase in the overall protein coverage results from all peptides being labeled. 114 115 116 117 31 28 29 30 145 +

As these tags are isobaric in MS, quantitation occurs in MS/MS using reporter ions. Investigation of 75,000 accumulated MS/MS spectra identified a quiet region between m/z of 113-119. Reporter ions reside in this quiet region.

Depiction of a multiplexed reaction of 4 different samples Depiction of a multiplexed reaction of 4 different samples. MS/MS spectra of iTRAQ™ reagent labeled peptide shows good y- and b- ions for peptide sequencing. Zoomed section shows the reporter ions used for quantitation. Efficient multiplexing (n=4) allows multiple comparisons across samples that enable the inclusion of duplicates and triplicates into experimental design.

MS/MS spectra of BSA peptide AEFVEVTK labeled with iTRAQ™ reagents shows a significant enrichment of both the y- and b- ions (without peak splitting), providing higher confidence in peptide identifications. Data collected on Q TRAP® System.