Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cinétique et stochiométrie Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale Taux initiaux Cuvée Chemostat Stop flow

Croissance cellulaire - variables X S P Taux de variation (kg/(m3.s) dX/dt dS/dt dP/dt Taux de production /consommation rx rs rp Taux spécifique (kg/(kg.s)  = rx/X qs= -rs/X qp= rP/X Rendement (kg/kg) Yx/s = rx/rs = /qp Yp/x, Yp/s

Mode d’opération Système fermé: cuvée (batch) Aucune entrée ou sortie Régime transitoire dX/dt = rX, dS/dt = rS À t = 0, X = X0, S = S0

Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin Alimentation seulement Régime transitoire À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0 F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc Si S est constant, m le sera aussi, m= mc V, X, S

Chemostat (continu, CSTR) F, Sin Une entrée, une sortie Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent: V= cst, X= cst, S= cst, P= cst F, S, X, P V, X, S, P

Chemostat avec recirculation Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur Permet de repousser le lavage Développement pour X seulement F F(1+w) F(1+w) Fc, Xc Fex, Xx V, X wF, Xx Bioréacteur Décanteur

Croissance cellulaire –type de modèles STRUCTURÉ/ SÉGRÉGÉ NON-STRUCTURÉ STRUCTURÉ NON-SÉGRÉGÉ + simple Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulaires Ségrégé: Tient compte d’une distribution de population

Modèles de croissance Du plus simple au plus compliqué Monod Exponentiel (ordre 0!!) Linéaire (logistique) Monod Autres Phénomènes connexes Maintenance Mortalité Production Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

Modèle enzymatique - Monod Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant: (1) (2) (3) Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!

Modèle de Monod Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire: Xmax-X = Yx/s * S Alors:

Modèle de Monod

Modèle de Monod Sachant que:

Modèle de Monod S = (Xmax-X)/Yx/s Données mmax= 1 Ks= 5 Yx/s= 0,5 So=   mmax= 1 Ks= 5 Yx/s= 0,5 So= 20 Xo= 0,1 S = (Xmax-X)/Yx/s

Détermination théorique Cinétique… Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire [C6H12O6]n C6H12O6 G3P glycerol purines pyruvate Acétyl-CoA lactate Acides gras éthanol Lipides Ac.aminés pyrimidines Cycle de Krebs Acides nucléiques protéines NAD+ ATP H2O NADH ADP O2 Chaîne respiratoire Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH Modèle stochiométrique (cliquez ici)

Autres valeurs du coefficient de rendement (Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)

Détermination expérimentale Coefficient de rendement Cinétique Taux initiaux Stop-flow Cuvée Chemostat

Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant Données   mmax= 1 Ks= 5 Yx/s= 0,5 So= 20 Xo= 0,1 S = (Xmax-X)/Yx/s

Estimation des rendements en cuvée Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S: Ici, Yx/s = 0,5

Effet de maintenance S = S(croissance) + S(maintenance) rS = 1/YG* rX + m * X qs = 1/YG* m + m 1/Yx/s = qs/m = 1/YG + m/ m

Effet de maintenance 1/Yx/s = qs/m = 1/YG + m/ m

Effet de mortalité Le taux de mortalité cellulaire: rd = - kd*X où kd=cste Donc en cuvée: dX/dt = m*X – kd*X = (m– kd)*X En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement glutamine -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma) GLUCOSE PYRUVATE TCA cycle, resp. chain lactate glucose pyruvate GLUTAMINE GLUTAMATE OU NH3 glutamate

Détermination de la cinétique – Taux initiaux Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés. Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Réactif 1 Réactif 2 Temps mort : Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange) Mélangeur Lumière Détection De l’ordre de 1 milliseconde. Moteur Moteur

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de : Photodiodes Dichroïsme circulaire Tube photomultiplicateur Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires. Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Types d’étanchage : Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M) Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Moteur Réactif 1 Réactif 2 Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes Mélangeur Agent étanchant Mélangeur Chambre réactionnelle linéaire Récupération des fractions

Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques : Spectroscopie de masse « en ligne » Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse Électrophorèse sur gel, Comptage à scintillation, etc…

Estimation des paramètres de Monod en cuvée Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement: ÷t ÷t Y = b + m X

Monod – estimation des paramètres mmax = 1 m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax Ks= 0,2475*10,1/0,5 Ks= 5

Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques Relation cinétique, par exemple Monod:

Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin Alimentation seulement Régime transitoire À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0 F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc Si S est constant, m le sera aussi, m= mc V, X, S

Cuvée alimentée (Fed-batch) 3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système: F ….

Cuvée alimentée (Fed-batch)

Cuvée alimentée (Fed-batch) F

Cuvée alimentée (Fed-batch)