LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE Mardi 29 janvier 2008 LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE

Plan I - Vue générale de la phase M II - Mitose III - Cytocinèse

II – Mitose

Mitose : fuseau mitotique Mardi 29 janvier 2008 Mitose : fuseau mitotique Émanation du cytosquelette : microtubules + protéines associées Séparation des chromosomes filles vers les pôles Ecartement des pôles p1036

2 événements Fuseau : dans le cytoplasme Mardi 29 janvier 2008 2 événements Fuseau : dans le cytoplasme Condensation des chromosomes : dans le noyau Prométaphase : mélange des deux compartiments  p1036

Les microtubules p1037 Capturent les chromosomes Mardi 29 janvier 2008 Les microtubules Capturent les chromosomes Intervention des moteurs Proches des extrémités des microtubules Famille des kinésines (  extrémité +) Famille des dynéines (  extrémité -) Extrémités des microtubules Site d’assemblage et de désassemblage des microtubules Lieu de production de force Fuseau Équilibre entre les deux forces opposées (moteurs + et moteurs -) p1037

Les trois classes de microtubules MT astraux Irradient dans toutes les directions Séparation des pôles Poignées d’orientation et de positionnement du fuseau dans la cellule MT du kinétochore Liés au kinétochore Fixent les chromosomes au fuseau MT chevauchant (polaires) Symétrie bipolaire du fuseau

Fig 18-10 Les trois classes de microtubules Mardi 29 janvier 2008 Les trois classes de microtubules MT astraux MT du kinétochore MT chevauchant (polaires) Toutes les extrémités – sont vers le centrosome Fig 18-10 p1037

Rappel sur les microtubules interphasiques Mardi 29 janvier 2008 Rappel sur les microtubules interphasiques Réseau de microtubules émanant du centrosome Instabilité dynamique Croissance  raccourcissement = catastrophe Raccourcissement  Croissance = restauration #1p1037

Plan Prophase Prométaphase Métaphase Anaphase Télophase Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction - Prométaphase Métaphase Anaphase Télophase

A – Prophase Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction -

1 - Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines

Changement brutal des microtubules en prophase : le constat Mardi 29 janvier 2008 Changement brutal des microtubules en prophase : le constat Longs et peu nombreux (interphase)  Plus nombreux et plus courts Effondrement de la demi-vie des microtubules Augmentation de l’instabilité des microtubules Augmentation du nombre de microtubules irradiant du centrosome Par modification des centrosomes qui augmentent leur taux de nucléation #1p1038

Mardi 29 janvier 2008 Les microtubules mitotiques sont différents des microtubules interphasiques Fig 18-11 #1p1038

Mardi 29 janvier 2008 Protocole d’étude Cellule en culture (lignée PTK1 et BSC) injectée avec tubuline-fluorochrome (dichlorotriazinyl-aminofluorescein (DTAF-tubulin)) Irradiation avec un rayon laser d’une petite surface jusqu'à extinction de la fluorescence Evaluation de la réapparition de la fluorescence en fonction du temps #1p1038

Saxton, WM J Cell Biol 99:2175, 1984 #1p1038 Mardi 29 janvier 2008 Saxton, WM J Cell Biol 99:2175, 1984 FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase and an interphase cell. Examples of relative fluorescence intensity plotted against time after photobleaching for a metaphase cell (●) and an interphase cell (○). Circles represent data points determined by microdensitometry of negatives. Lines represent best fitting curves using the function l/lmax = 1 – e –kt (30). The t½ for each curve is noted on the X axis. #1p1038 Saxton, WM J Cell Biol 99:2175, 1984. FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase and an interphase cell. Examples of relative fluorescence intensity plotted against time after photobleaching for a metaphase cell (●) and an interphase cell (○). Circles represent data points determined by microdensitometry of negatives. Lines represent best fitting curves using the function l/lmax = 1 – e –kt (30). The t½ for each curve is noted on the X axis.

Mardi 29 janvier 2008 Changement brutal des microtubules en prophase : mécanisme de déclenchement en début de mitose M-Cdk phosphoryle Des moteurs protéiques Des MAPs (Microtubule Associated Proteins) (leur phosphorylation  diminution de la stabilité des microtubules)  contrôle de la dynamique des microtubules Démonstration par biochimie chez Xenopus #1p1038

Xenopus #1p1038 Extrait d’œuf de Xenopus en phase M ou en interphase + Mardi 29 janvier 2008 Xenopus Extrait d’œuf de Xenopus en phase M ou en interphase + Centrosome + tubuline fluorescente  Nucléation des microtubules à partir des centrosomes (Analyse en vidéo microscopie à fluorescence « time-lapse ») Mais #1p1038 Extraits mitotiques  taux très élevé de catastrophes Extraits interphasique  taux plus bas de catastrophes #1p1038

Les catastrophines Protéines Augmentent la fréquence des catastrophes Mardi 29 janvier 2008 Les catastrophines Protéines Augmentent la fréquence des catastrophes #1p1038

Mardi 29 janvier 2008 Les catastrophines #1p1038

Fig 16-55 Kinésines et Kinesin-related proteins #1p1038 KIF2 Mardi 29 janvier 2008 Kinésines et Kinesin-related proteins KIF2 moteur au milieu de la chaîne lourde pas d'activité moteur classique se lie aux extrémités des microtubules pour augmenter leur instabilité dynamique  nom de catastrophine Fig 16-55 #1p1038

Antagonisme catastrophines / MAPs Mardi 29 janvier 2008 Antagonisme catastrophines / MAPs #1p1038

Antagonisme catastrophines / MAPs Mardi 29 janvier 2008 Antagonisme catastrophines / MAPs Microtubules plus dynamiques en phase M Par action sur catastrophines et MAPs  Augmentation du taux de dépolymérisation des microtubules (catastrophines) Diminution du taux de dépolymérisation des microtubules (MAPs) Augmentation et diminution du taux de dépolymérisation des microtubules #1p1038

Mardi 29 janvier 2008 Contrôle de la longueur des microtubules par l'équilibre entre catastrophines et MAPs Catastrophes avec extraits mitotiques > catastrophes avec extraits interphasiques Fig 18-12(A) #1p1038

Centrosomes et noyaux de spermatozoïdes dans des extraits mitotiques Extraits mitotiques normaux  fuseau normal Déplétion en XMAP215  fuseau très anormal Probablement parce que les microtubules nucléés par les centrosomes sont trop courts Mardi 29 janvier 2008 Mitose dans un extrait normal Fig 18-12(B) #1p1038 Mitose dans un extrait dépléte en XMAP215

Mardi 29 janvier 2008 Spindle formation observed in control and XMAP215-depleted extracts. Microtubule arrays are seen in control (left) and XMAP215-depleted (right) extracts 20 and 45 min after addition of sperm nuclei. Spindles are seen 45 min after sperm addition. Scale bar represents 10 µm. 20 mn 20 mn Régis Tournebize, Andrei Popov, Kazuhisa Kinoshita, Anthony J. Ashford, Sonja Rybina, Andrei Pozniakovsky, Thomas U. Mayer, Claire E. Walczak, Eric Karsenti & Anthony A. Hyman Control of microtubule dynamics by the antagonistic activities of XMAP215 and XKCM1 in Xenopus egg extracts Nature Cell Biology  2, 13 - 19 (2000) 45 mn 45 mn #1p1038 Figure 7. Spindle formation observed in control and XMAP215-depleted extracts. Microtubule arrays are seen in control (left) and XMAP215-depleted (right) extracts 20 and 45 min after addition of sperm nuclei. Spindles are seen 45 min after sperm addition. Scale bar represents 10 µm. Les fuseaux deviennent visibles 45 min après l’ajout des spermatozoïdes

2 - Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction –

Propriétés des microtubules Mardi 29 janvier 2008 Propriétés des microtubules Si monomérique : le moteur se déplace Si multimérique : liaison de 2 microtubules adjacents qui peuvent se déplacer l’un par rapport à l’autre Génération de foyers à extrémités moins  pôles du fuseau Glissement de microtubules l’un par rapport à l’autre  zone de chevauchement dans le fuseau #2p1039

Fig 18-13 #2p1039 Importance des moteurs multimériques pour Assemblage Mardi 29 janvier 2008 Importance des moteurs multimériques pour Assemblage fonctionnement des microtubules Fig 18-13 #2p1039

Assemblage du fuseau = équilibre Mardi 29 janvier 2008 Assemblage du fuseau = équilibre Croissance de microtubules à partir de chaque centrosome  les microtubules ont des polarités opposées Association de moteurs à déplacement +  Écartent les centrosomes Des moteurs à déplacement -  Rapprochent les centrosomes Formation du fuseau = équilibre entre les deux #2p1040

Fig 18-14 #2p1040 Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à Mardi 29 janvier 2008 Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à des moteurs + (kinésine): rencontre de deux microtubules polaires de polarité opposée des moteurs – (dynéine) associés à l’enveloppe nucléaire via les microtubules astraux Fig 18-14 #2p1040

Fig 18-14 #2p1040 Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à Mardi 29 janvier 2008 Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à des moteurs + (kinésine): rencontre de deux microtubules polaires de polarité opposée des moteurs – (dynéine) associés à l’enveloppe nucléaire via les microtubules astraux Fig 18-14 #2p1040

Régulation de la longueur du fuseau : les moteurs du fuseau Mardi 29 janvier 2008 Régulation de la longueur du fuseau : les moteurs du fuseau Vertébrés : 7 familles de moteur apparentés à la kinésine S. cerevisiae : 5 familles de moteur Augmentation du moteur +  fuseau anormalement long Augmentation du moteur -  fuseau anormalement court #2p1040

L'influence de moteurs à sens de marche opposé sur la longueur du fuseau mitotique Kar 3p : moteur vers - Cin 8p : moteur vers + Mardi 29 janvier 2008 Normal moteur -  fuseau court  moteur +  fuseau long Fig 18-15 Chez la levure il n’y a pas de rupture de l’enveloppe nucléaire pendant la mitose Fuseau Pôles du fuseau #2p1040

Chez l’homme Probablement comme chez la levure Mardi 29 janvier 2008 Chez l’homme Probablement comme chez la levure La phosphorylation d’au moins un moteur par M-Cdk est nécessaire pour la fixation du moteur au fuseau #2p1040

B – Prométaphase Rupture soudaine de l’enveloppe nucléaire Mardi 29 janvier 2008 B – Prométaphase Rupture soudaine de l’enveloppe nucléaire Déclenchée par la phosphorylation directe des lamines nucléaires par M-Cdk Les microtubules accèdent aux chromosomes pour la 1ère fois #3p1040-1041

Mardi 29 janvier 2008 Conséquences Phénomène de « recherche et capture » des chromosomes par les microtubules Un microtubule qui rencontre un chromosome s’attache et se stabilise  plus (zéro) de catastrophes Peut rencontrer un kinétochore : S’attache par l’extrémité (bout + du microtubule) Le microtubule s’appelle alors « microtubule du kinétochore » #3p1041

Fig 18-16 #3p1041 Les microtubules du kinétochore Mardi 29 janvier 2008 1 à 40 microtubules par kinétochore Fig 18-16 #3p1041 ADN & les 2 kinétochores

Mardi 29 janvier 2008 Les kinétochores #3p1041

Fig 18-19 Microscopie électronique d'un kinétochore #3p1042 Mardi 29 janvier 2008 Microscopie électronique d'un kinétochore Fig 18-19 #3p1042 Structure trilamellaire

Mardi 29 janvier 2008 Kinétochore Rôle capital dans le mouvement des chromosomes sur le fuseau Contiennent des moteurs + et des moteurs – Mode d’attachement des microtubules aux kinétochores inconnu (d’autant plus que ce bout + se polymérise et se dépolymérise constamment) #3p1042

Mardi 29 janvier 2008 Kinétochore #3p1042

Mardi 29 janvier 2008 Microtubule Capture: A Concerted Effort Chitra Kotwaliwale and Sue Biggins Cell, Volume 127, Issue 6 , 15 December 2006, Pages 1105-1108 Attachement du kinétochore aux microtubules et sa régulation par Aurora B Le kinétochore – structure protéique qui se forme au contact de l’ADN centromérique-est composé de multiples protéines de liaison de faible affinité au microtubule. Alors que le complexe Ncd80 se lie à la charpente en réseau du microtubule, d’autres composants peuvent se lier à l’extrémité plus du microtubule. En réponse à des forces de tension, Aurora B phosphoryle les protéines de liaison au microtubule pour diminuer l’affinité de ces facteurs aux microtubules. Ceci conduit au détachement des microtubules des kinétochores. Des facteurs comme INCENP-survivine peuvent exercer de nombreuses fonctions au niveau du kinétochore. En plus de leur rôle de senseurs de tension régulés par Aurora B, ces molécules peuvent aussi promouvoir une activité de liaison au noyau du microtubule #3p1042 Kinetochore Attachment to Microtubules and Its Regulation by Aurora B The kinetochore—a proteinaceous structure that forms on centromeric DNA—is composed of multiple low-affinity microtubule-binding components. Although the Ndc80 complex binds to the microtubule lattice, other components may bind to the microtubule plus end. In response to tension defects, Aurora B phosphorylates the microtubule-binding proteins to decrease the affinity of these factors for microtubules. In turn, this leads to detachment of microtubules from kinetochores. Factors such as INCENP-Survivin may perform multiple functions at the kinetochore. In addition to serving as tension sensors that are regulated by Aurora B, these molecules may also promote core microtubule-binding activity.

Mardi 29 janvier 2008 Kinétochore The kinetochore is a specialized chromosomal structure that facilitates chromosome attachment and movement along spindle microtubules during chromosome segregation. Furthermore, the kinetochore communicates the actual state of its interaction with the spindle to a cell cycle regulating machinery. It is the first member of a signaling cascade that inhibits sister chromatid separation (the beginning of anaphase) if chromosomes lack a stable bi-polar spindle attachment. A defect in this checkpoint function has been correlated to human cancers. My group analyses the protein composition and structure of the S. cerevisiae kinetochore by mass spectroscopy and the function of individual kinetochore proteins applying cell and molecular biological methods.             #3p1042 The kinetochore is a specialized chromosomal structure that facilitates chromosome attachment and movement along spindle microtubules during chromosome segregation. Furthermore, the kinetochore communicates the actual state of its interaction with the spindle to a cell cycle regulating machinery. It is the first member of a signaling cascade that inhibits sister chromatid separation (the beginning of anaphase) if chromosomes lack a stable bi-polar spindle attachment. A defect in this checkpoint function has been correlated to human cancers. My group analyses the protein composition and structure of the S. cerevisiae kinetochore by mass spectroscopy and the function of individual kinetochore proteins applying cell and molecular biological methods.

Kinétochore #3p1042 Hierachical Structure of the Yeast Kinetochore Mardi 29 janvier 2008 Hierachical Structure of the Yeast Kinetochore A small CEN DNA interacts with CBF3, an inner kinetochore complex that recruits a specialized nucleosome. Together these complexes recruit multiple discrete protein complexes, ultimately resulting in a large structure that mediates the attachment and movement of chromosomes on the mitotic spindle. Kinétochore #3p1042

Attachement des microtubules aux kinétochores Mardi 29 janvier 2008 Attachement des microtubules aux kinétochores Facile à observer dans les cellules de poumon de têtard Liaison par le côté du microtubule Puis glissement rapide vers le centrosome Puis l’attachement latéral est converti en fixation par l’extrémité En même temps attachement de l’autre kinétochore par les microtubules du centrosome opposé  Attachement bipolaire du chromosome #3p1041-2

Fig 18-17 #3p1042 Capture des microtubules par les kinétochores Mardi 29 janvier 2008 Fig 18-17 Capture des microtubules par les kinétochores #3p1042

Constitution de la plaque métaphasique Mardi 29 janvier 2008 Constitution de la plaque métaphasique Les chromosomes sont tirés d’avant en arrière  Position équidistante des pôles  Plaque métaphasique #3p1042

Fig 18-18 #3p1042 5 m Plaque métaphasique : chromosomes Kinétochores Mardi 29 janvier 2008 Fig 18-18 #3p1042 Plaque métaphasique : chromosomes Kinétochores Microtubules 5 m

Plaque métaphasique #3p1042 Oscillation des chromosomes… Mardi 29 janvier 2008 Plaque métaphasique Oscillation des chromosomes… en attendant le signal de la séparation… qui est le dernier signal négatif émis par le dernier kinétochore #3p1042

C - Métaphase

PAUSE

Fig 18-20 Dynamique des microtubules du fuseau métaphasique rhodamine - tubuline en rouge colorant bleu pour l'ADN Fluorescéine (caged) - tubuline en vert Mardi 29 janvier 2008 1,5 mn Fluorescéine invisible parce que « cagée » Fig 18-20 2,5 mn 10 m « décageage » de la fluorescéine par UV juste à gauche de la plaque métaphasique

Fig 18-21 Microscopie à fluorescence de microtubules isolés Mardi 29 janvier 2008 Microscopie à fluorescence de microtubules isolés Fig 18-21

Mardi 29 janvier 2008 Alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique par des forces opposées Fig 18-22

Mardi 29 janvier 2008 Assemblage du fuseau sans centrosome dans un embryon parthénogénétique d'insecte Sciara (absence d'aster) Fig 18-23

D - Anaphase Anaphase A Anaphase B

Mardi 29 janvier 2008 Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome ni kinétochore Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence d'extrait d'oeuf de Xenopus Fig 18-24(A)

Mardi 29 janvier 2008 Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome ni kinétochore Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence d'extrait d'oeuf de Xenopus Fig 18-24(B)

Fig 18-25 Séparation des chromatides en anaphase Mardi 29 janvier 2008 Séparation des chromatides en anaphase Microtubules colorés par des AC anti tubuline marqués à l'or Fig 18-25

Fig 18-25A Forces qui séparent les chromosomes en anaphase A Mardi 29 janvier 2008 Fig 18-25A

Fig 18-25B Forces qui séparent les chromosomes en anaphase B Mardi 29 janvier 2008 Forces qui séparent les chromosomes en anaphase B Fig 18-25B

Deux modèles de migration du kinétochore vers le pôle pendant l'anaphase A Mardi 29 janvier 2008 Fig 18-27

Mardi 29 janvier 2008 Diminution de la zone de chevauchement des microtubules chevauchant de la métaphase à l'anaphase chez les diatomés Fig 18-28

Fig 18-29 Fonctionnement des moteurs protéiques pendant l'anaphase Mardi 29 janvier 2008 Fig 18-29