12 juin 2006 Thème : Culture et production de cellules phytoplanctoniques. Réponses du phytoplancton aux ajouts de contaminants métalliques. Caractérisation structurale des exsudats - Laboratoire d’accueil : PROTEE-CAPTE (Toulon) Maître de stage : M. C. Le Poupon Mme. Ortalo-Magne Annick, Orateur: MARZOUKI Mohamed CHARME

Carbone organique extracellulaire publication 1 Amélioration de la connaissance des phénomènes chimiques dans l’environnement côtier but Carbone organique extracellulaire (exsudat) Cultiver et produire des cellules de diatomées 2 . Isoler et caractériser leurs polymères CHARME

Intérêt de travail Carbone organique extracellulaire (exsudat) publication 1 Intérêt de travail Carbone organique extracellulaire (exsudat) importance écologique : source d’énergie causer des changements sur l’écosystème CHARME

Analyse des données bibliographiques publication 1 Secteur d’étude La petite rade de Toulon - grande activité humaine - industrie chimique - port commercial et militaire Apport conséquent en Contaminants variés CHARME

Lumière pour la photosynthèse publication 1 Analyse des données bibliographiques La connaissance de trois termes suivants: - Phytoplancton - Polysaccharide - cuivre Phytoplancton croit prés de la surface première chaîne alimentaire la production de la matière organique(MO) équivalent à l‘ensemble de la végétation terrestre puis de CO2 peut avoir une grande influence sur le climat par l’échange de CO2 Lumière pour la photosynthèse CHARME

Analyse des données bibliographiques Polysaccharides - les plus abondants dans les océans - présentent une grande surface active permettant de jouer un rôle dans la fixation des polluants métalliques il y a deux types de polysaccharides - polysaccharides de réserve: source d’énergie - polysaccharides structuraux [Cx(H2O)y)]n- (où y est généralement x – 1) Cuivre - le plus complexé par la MO - on le trouve partout dans l’environnement - Facile à analyser CHARME

Cultiver et produire des cellules de diatomées publication 1 Méthodologies Cultiver et produire des cellules de diatomées Souche naturelle de diatomée - Prélèvement: rade de Toulon - Concentrer par filtration inverse - Isolation par dilutions successives - Repartir entre différents erlen-meyer Dans un milieu f/2: f/2: Solution de sels nutritifs Solution métallique Solution vitaminique cylindrotheca Closterium CHARME

Méthodologies Le développement des cultures se fait : publication 1 Méthodologies Le développement des cultures se fait : - Chambre thermostaté 17°C - Éclairement contenu Éclairement contenu plus d’exsudation CHARME

Les Conditions optimales de la culture publication 1 Méthodologies Les Conditions optimales de la culture Travail précédent M2 a permit d’obtenir les résultats suivants: 1- la croissance algale se fait selon 3 phases Phase exponentielle Phase stationnaire Phase de latence CHARME

Méthodologies 2- la production de polysaccharides est maximale à la phase stationnaire Phase stationnaire Pour obtenir le maximum d’exsudation Travail dans les mêmes conditions - dans une chambre thermostatée 17°C - Éclairement contenu - l’arrêt de la culture à la phase stationnaire - Double densité cellulaire - Augmentation de volume 4 fois On a ajouté CHARME

Méthodologies Suivre la croissance et l’excrétion phytoplanctonique - L’étape de la croissance - Concentration du carbone organique totale 1- Suivre la croissance - Comptage - Concentration en chlorophylle-a Microscope Fluorescence 2- Suivre l’excrétion d’exsudats - concentration de COD - concentration de glucose analyseur TOC Spectroscopie UV-visible analyseur TOC CHARME

Méthodologies Isolement CHARME Culture en phase stationnaire (7 jours) Arrêt de la culture par filtration (0,45 µm) Filtrat surnageant Séchage Extraction avec NaCl 1,5 M + Agitation Centrifugation 30’/4°C Filtration 0, 45µm Ultrafiltration, (dialyse concentration) 1kDa Rotavapor Partage CHCl3/MeOH/H2O Phase Organique Phase aqueuse Ethnol. (4fois V)/4°C/1 nuit Centrifugation 30’/4°C CHARME EPS liée EPS libre

Caractérisation structurale des exsudats publication 1 Méthodologie Caractérisation structurale des exsudats 1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 3- Voltampérométrie à redissolution anodique (DPASV). 4- Spectre Infra Rouge IR 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) - déterminer les compositions monosaccharidiques - taux de glucides 4- Spectre Infra Rouge IR voir les groupements fonctionnels qui peuvent complexer le cuivre 1- Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) - mettre en évidence l’existence des polysaccharides - la différence de structure entre les deux phases, particulaire et dissoute - la différence entre les deux milieux (sain et pollué) 3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV). - l’adaptation des cellules aux deux concentrations d’un polluant métallique - envisager le déroulement des mécanismes de détoxification CHARME

1- Culture et production de cellules phytoplanctoniques. ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 1- Culture et production de cellules phytoplanctoniques. Témoin 0 Cu 3 erlen-meyer x 1L 500 ppb Cu 3 erlen-meyer x 1L 1000 ppb Cu 3 erlen-meyer x 1L 3 jours Phase exponentielle Phase stationnaire Phase latence CHARME

ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Deuxième culture Troisième culture Troisième culture - Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente pour les trois cultures réalisées? - Pourquoi la croissance des cultures est-elle différente par rapport aux recherches précédentes pour des espèces voisines ? - Pourquoi y a t-il une chute de COD dans la première culture ? - Quelle transformation a subi le COD dans la première culture ? CHARME

ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES publication 1 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES On considérer qu’il y a - Une culture homogène - Une seule espèce en réalité - Culture hétérogène - Il y a d’autres micro-organismes (bactérie…….) Pour avoir une bonne culture il faut: - Sélection par prélèvement contenu 4, 5 fois - élimination des autres espèces (bactérie) - Ajuster les facteurs influencent la culture (lumière, température,….) La disparition de COD dans la première culture: - Consommation bactérienne - Précipitation CHARME

Isolement ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES publication 1 ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES Isolement masse polysaccharide ppb Cuivre EPS libre EPS liée la première culture (7 jours) Témoin 6,05 5,6 500 8,02 8,17 1000 6,9 1,84 la deuxième culture (11 jours 1 /2) 1 – 2,15 1,55 La quantité de polysaccharides dans la phase dissoute est plus important que sur les cellules Dans la phase stationnaire la quantité de polysacch est plus importante La quantité augmente avec la [ ] de cuivre - 500 ppb Cu: utilisation de polysacch pour la détoxification - 1000 ppb Cu: non adaptation au milieu, mortalité CHARME

Spectre H-RMN ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 0 ppb Cu PES Libre 0 ppb Cu PES Liée Il n’a y pas nécessité de se protéger la quantité des EPS faibles CHARME

1- Spectre H-RMN ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 500 ppb Cu PES Liée 500 ppb Cu PES Libre Existence des EPS Différence - l’intensité - l’environnement moléculaire CHARME

2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). α = temps de rétention Q = la quantité de chaque monosaccharide en µL R%= le pourcentage de chaque monosaccharide - = traces monosaccharides non quantifiés   Arabinose Rahmanose Manose Xylose Galactose Glucose α Q P 1,06 0,03 3,41 1,12 0,49 50 0,11 11,2 1,1 11 0,12 12 0,1 5,54 ESP Libres 500 - 0,74 74 0,07 7 0,15 15 0,2 35 10 1000 0,09 9,11 0,14 14,9 0,34 34 0,35 1 1,13 ESP Liés 0,42 42 0,06 6 0,04 4 0,13 13 0,8 8 3 0,08 0,02 2 Identification des 6 monosaccharides (/ références) pour les 6 EPS La même origine CHARME

La pourcentage augmente en milieu contaminé ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). xylose Galactose Glucose 3 0,03 1,12 2 0,02 1,04 8 0,08 1,09 1000   11 0,11 13 0,13 1,05 4 0,04 500 ESP Liés - 15 0,15 35 0,35 34,4 0,34 10 0,1 1,11 0,2 ESP Libres 5,54 0,05 12 0,12 11,3 P % Q α La pourcentage augmente en milieu contaminé EPS Liés renouvellement EPS Libres Accumulation CHARME

3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV). ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 3- Voltampérométrie de redissolution anodique (DPASV). Nous continuons encore à ajuster notre protocole [ ] Cu = 1000µM [ ] ESP = 1mg/l - les ESP ont une grande capacité complexante - les ESP en milieu contaminé est plus complexant CHARME

4 Infra rouge (IR) 1- sur les cellules déconvolution ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 4 Infra rouge (IR) 1- sur les cellules 1000 Témoin 500 déconvolution 500 Témoin 1000 Cu 500 ppb Témoin Cu 1000 ppb Superposition des bandes + déplacement de certaines fréquence du fait de leur environnement structurale = Distinction nette est très difficile des bandes CHARME

4 Infra rouge (IR) 1- Des cellules déconvolution ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 4 Infra rouge (IR) 1- Des cellules Cu 1000 ppb Témoin Cu 500 ppb déconvolution Associés à des liaison de compléxation M-O (O acide carboxylique) Les fonctions structurales sont associées au métal CHARME

4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 0 ppbCu 500 ppbCu 1000 ppbCu Absorption plus important quand la [ ] Cu augmente Attribuée à l’utilisation des fonctions organiques dans Les liaisons M-O/O-M-O Sont moins intenses Attribué à l’augmentation de la contribution des Bandes de vibration Métal-N CHARME

4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES 0 ppbCu 500 ppbCu quasi-absent 1000 ppbCu Existence da l’acide uronique Absence des signaux de CH2 et CH3(2924,2854) principalement composé d’acide uronique Illustre bien la mobilisation des ses groupes fonctionnels avec le Métal quasi-absent CHARME

Conclusions et perspectives Ce stage nous a permit: - amélioration des connaissances des cultures - confirmation de certains résultats sur l’exsudation - caractérisation structurale des polysaccharides La présence des différentes composés Le pourcentage relatif de certains croit avec la [ ] en Cu La contamination augmente les sites complexants jouer un rôle considérable dans le mécanisme de détoxification - La sélection des individus qui ont les mêmes caractéristiques - Traitement spécial pour éliminer tous micro-organismes culture homogène - Le développement cellulaire est affecté par la contamination métallique - L’exsudation est d’autant plus importante que le milieu est contaminé perspectives - Orientation vers une caractérisation fine des exsudats - Travail multiparamètrés sur différentes espèces phytoplanctoniques et contamination par plusieurs métaux lourds CHARME

Merci pour votre attention CHARME