LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS ET LEUR CONTRÔLE Jean François SALUZZO Consultant WHO

1. LA FABRICATION DES VACCINS - La production de principe actif - La mise sous forme pharmaceutique 2. LA QUALITE DES VACCINS 3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE VACCINS

Les Vaccins simples à usage humain Vaccins bactériens Vaccins viraux BCG Rougeole Rubéole Oreillons Varicelle Fièvre Jaune Polio orale Rotavirus VACCINS VIVANTS Méningite Typhoïde Pneumocoque Haemophilus* Coqueluche Rage Polio inject. Hépatite A Encéphalite japonaise Grippe Papillomavirus Hépatite B acellulaire Diphtérie Tétanos VACCINS INERTES

Fabrication d’un vaccin

LES ACTEURS Les bactéries Les virus Les cellules eucaryotes : - pour productions virales - pour production par génie génétique Hépatite B : levures ou cellules de Hamster chinois POUR PRODUIRE DES VACCINS DE QUALITE, IL FAUT DISPOSER DE GERMES BIEN CARACTERISES ET DE PROPRIETES CONSTANTES

LE SYSTEME DES SEMENCES PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE

LA CULTURE DES BACTERIES SEMENCE : congelée ou lyophilisée INOCULUM : repiquage sur milieux nutritifs (liquides ou gélosés) PRECULTURE : petit fermenteur (quelques dizaines de litres) - phase de croissance CULTURE : fermenteurs de plusieurs centaines ou milliers de litres - phase de croissance - phase d'expression des antigènes

LA CULTURE DES BACTERIES Milieux complexes (bactéries fastidieuses) Matières premières contrôlées (analyses, origine) Stérilité, asepsie Maîtrise des paramètres de culture - temps - pureté pH - température - numération - pression - aspect des germes - mousse - métabolites - agitation - aération

LA CROISSANCE EXPONENTIELLE

Dans la culture des bactéries, on recherche : - de grands volumes - une très forte aération - une très forte agitation - des milieux concentrés pour augmenter les concentrations bactériennes

LA CULTURE DES VIRUS Les virus sont des êtres rudimentaires, parasites obligatoires des cellules. Leur culture implique nécessairement la culture préalable de cellules animales Cellules animales Culture cellulaire Infection Culture virale  Virus

Les cultures de cellules animales 1) Cultures sur organes Ensemencement d ’œufs embryonnés de poule - cavité amniotique : Vaccin oreillons - cavité allantoïdienne : Vaccin grippe 2) Organes animaux mis en culture (cellules primaires) - dilacération, trypsination des tissus animaux (reins de singes, embryons de poulets) ex. Vaccin rougeole Cellules diploïdes à durée de vie limitée (origine embryonnaire) Cellules MRC5 (vaccin rage)

Les cultures de cellules animales 4) Lignées de cellules animales (cellules hétéroploïdes) - cellules immortalisées (vero, MDCK, PERC6) - multiplication sur des surfaces adhérentes - ou multiplication sur billes ou en suspension (avenir) Les lignées de cellules non-tumorigènes ne croissent que sur un support solide, et s'arrêtent de croître au contact les unes des autres ex. : vaccins polio injectable et oral ; vaccin hépatite B ; vaccin rage ; vaccin rubéole ….

Dans la culture des cellules animales, on recherche : - de grandes surfaces - une faible aération, généralement accompagnée de CO2 - une agitation faible ou nulle - des milieux iso-osmotiques, c'est-à-dire dont l'osmolalité est proche de celle du sang (# 285 mmol/kg)

Récipients de culture virale :

La récolte des cultures - Soit: Elimination du milieu par centrifugation aseptique (coqueluche cellulaire, levures pour vaccin Hépatite B) - Soit: Récolte du milieu et sauvegarde ou élimination des cellules par centrifugation ou filtration aseptique (antigènes solubles ou virus excrétés) : vaccin viraux Note : dans ce dernier cas, on peut parfois effectuer plusieurs récoltes et renouvellements du milieu, si les virus ne sont pas lytiques

La concentration des antigènes - par précipitation à l'aide de sels (sulfate d'ammonium) ou de solvants (éthanol, polyéthylène glycol) - [ex. anatoxines, polyosides] - par ultrafiltration sur membranes filtrantes minérales ou organiques, à pouvoir de coupure calibré (pouvoir de retenir les grosses molécules) - 10 000, 50 000, 100 000, 300 000 daltons ex. : vaccin polio; rage.

La purification BUT : Séparer les antigènes recherchés de l'extrait brut concentré obtenu après récolte. - MOYENS : Procédé effectué par étapes successives, qui s'adressent à des propriétés spéciales de l'antigène, pour le sélectionner parmi la masse des autres composants.

La précipitation fractionnée Exemple : - sels de calcium, d'ammonium - solvants : éthanol, méthanol polyéthylène glycol Ici, on insolubilise tour à tour les différentes molécules présentes dans le mélange.

La chromatographie Technique Caractère discriminant - échanges d'ions (propriétés électriques des molécules) - hydrophobe (hydrophilie des molécules) - gel d'exclusion (taille des molécules) - affinité (attirance des molécules par un motif : ligand)

L'ULTRACENTRIFUGATION La purification - 3 L'ULTRACENTRIFUGATION Centrifugeuses soumises à des accélérations de plusieurs dizaines de milliers de fois la pesanteur terrestre ; on peut trier les molécules, en les sédimentant : - par taille (ultracentrifugation de vélocité) - par densité (ultracentrifugation isopycnique dans un milieu de densité croissante)

L'inactivation Certains antigènes sont inoffensifs - polyosides bactériens - germes atténués (virus rougeoleux, BCG) D'autres sont pathogènes - toxines (diphtérique, tétanique) - germes virulents (B. pertussis, virus rabique) Pour ces derniers, une fois purifiés, il faut inactiver leur pouvoir pathogène, c'est l'inactivation.

L'inactivation (suite) Par la chaleur (B. pertussis) Par des agents chimiques (formol, Beta-propiolactone, …) L'inactivation doit être totale, et respecter les structures immunogéniques de l'antigène.

SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000

Les contrôles de qualité des principes actifs Étapes Contrôles Qualité matières premières ANALYSES semences ANALYSES cultures ANALYSES récoltes ANALYSES purifications ANALYSES inactivations ANALYSES Les temps de contrôle représentent souvent plus des trois quarts du temps de cycle de la fabrication

Le Service des mélanges - Réceptionne les différentes valences antigéniques - Fabrique les valences vaccinales - A l'aide de diluants, de stabilisants et d'adjuvants, formule le vaccin final vrac en un lot homogène qui est soumis aux contrôles d'activité. L'ORDRE DES MELANGES, L'ASEPSIE, LA PRECISION DES MESURES, SONT PRIMORDIAUX POUR OBTENIR UN VACCIN DE QUALITE

Le Service de répartition - Lave et stérilise les contenants - Prépare l'équipement de remplissage - Connecte le produit vrac désiré - Remplit le produit dans les récipients finaux : seringues, ampoules, flacons. L'ASEPSIE DE TOUTES LES OPERATIONS, LA GESTION DES OBJETS DE REPARTITION, LA CHAINE DE FROID, SONT DES FACTEURS CRITIQUES DE LA REPARTITION.

La lyophilisation Certains antigènes, tels les vaccins vivants, sont trop fragiles pour être gardés en dilution liquide, même au froid. On a alors recours à la congélation (B.C.G., vaccin polio oral) ou, plus souvent, à la lyophilisation. La lyophilisation est la dessiccation d'une solution, congelée par évaporation de l'eau directement de l'état solide (glace), à l'état vapeur, sans passer par la phase liquide. Menée au froid et sous vide poussé, elle respecte les structures des molécules et des germes.

Le Service de conditionnement - Définit l'emballage secondaire du produit - Approvisionne les blisters, les étiquettes, les notices, les étuis carton - Prépare les machines (étiqueteuses, emballeuses) LES VIDES DE CHAINE, LA RIGUEUR DE LA COMPTABILITE DE TOUS LES OBJETS DE CONDITIONNEMENT, LA VERIFICATION DES TEXTES IMPRIMES SONT PRIMORDIAUX POUR ASSURER UNE FIABILITE DU TRAVAIL, PARMI UNE MULTIPLICITE DE PRODUITS FINAUX.

Caractéristiques propres aux fabrications de vaccins - Longueur des cycles de production - Nombreux contrôles - Origine des matières premières (traçabilité) - Combinaisons vaccinales multiples Médicaments préventifs Conséquences: -Absence de génériques (établir une équivalence biologique ou clinique)

Caractéristiques propres aux vaccins (suite) - Souches pathogènes - A-coups de production : (campagnes de vaccinations, épidémies) - Fragilité des principes actifs complexes - Asepsie - Chaîne de froid

La chaîne de froid Les antigènes sont tous des molécules complexes, fragiles. La lyophilisation, les stabilisants, le froid visent à garantir la stabilité, donc la qualité des vaccins.

La chaîne de froid s'applique partout - Chez le fabricant - Dans les expéditions - Dans les entrepôts (grossistes, pharmaciens, médecin) - Avant la vaccination (particuliers, dispensaires)

Lancement d'un nouveau vaccin 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 1 Années INDUSTRIALISATION PREUVE DU CONCEPT PREUVE DU PRODUIT Recherche Développement CONSTRUCTION DES INSTALLATIONS Lots d'uniformité Etudes de stabilité Etudes cliniques phase III Licence (AMM) Production Marketing Ventes en Europe Licences à l'étranger Ventes à l'étranger (essais sur animaux) (cliniques phase I et II)