FOR WINES CARACTERISATION H2 QUANTITATIVE NMR FOR WINES CARACTERISATION JM FRANCONI UMR 5536 / CNRS Université Victor Segalen 146 rue Léo-Saignat 33076 BORDEAUX CEDEX

S N I F Spécifique Naturel Isotopique Fractionnement

SNIF NMR LES INVENTEURS DU CONCEPT G. J. MARTIN M.L MARTIN

SNIF NMR REFERENCES L.A.I.E.M EUROFINS S. AKOKA M TRIERWEILLER F MABON G. MARTIN Fondamental research Economical valorisation

Définition: Stable isotope SNIF NMR STABLE ISOTOPE P P P P P P N nucleus N N P P P

STABLE ISOTOPE QUANTIFICATION SNIF NMR STABLE ISOTOPE QUANTIFICATION Lo représente la quantité d ’isotope lourd Le représente la quantité d'isotope léger ISOTOPIC RATIO R = Lo / Le (en ppm) Abondance isotopique A = Lo / (Le+Lo) la déviation isotopique di = ((Ri - Rref) / Rref).1000 R i rapport isotopique d'une substance i R ref rapport isotopique d'une référence

SNIF NMR STABLE ISOTOPES In foods and beverages we can find the following isotopes: isotopes abundance référence H2 / 1H 0.015% H2O V.SMOW C13 / C12 1.11% CaCO3 PDB N15 / N14 0.37% N2 de l'air O18 / 016 0.20% H2O V SMOW

Range of variation of isotopic composition SNIF NMR Range of variation of isotopic composition 70 X C13 H2 C13 / C12 H2 / H1 < 40 % 500 %

Difference between deuterium and proton SNIF NMR Difference between deuterium and proton électron électron P P N proton deutérium

SNIF NMR WATER ISOTOPIC DISTRIBUTION H H D H D O O D O H2O HOD D2O 0.015% 2.25 ppm

SNIF NMR deutérium(D/H) distribution Vénus 16 000ppm espace 0.01ppm Soleil mercure La Terre 155ppm Mars 900ppm

(D/H) variation with latitude SNIF NMR (D/H) variation with latitude 130ppm 160ppm

SNIF NMR (D/H) diminue (D / H) variation with altitude and ocean distance (D/H) diminue

A B SNIF NMR ISOTOPIC FRACTIONNEMENT MECHANISM Gaz phase Liquid phase EVAPORATION eau D / H liquide > D / H vapeur

SNIF NMR FRACTIONNEMENT - ORIGIN THERMODYNAMIC A-[D] B-[D] + C éthanol

SNIF NMR FRACTIONNEMENT - ORIGIN KINETIC A B + C AH AD AH BH AD BD

SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT IN THE VINE ?

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT CLIMAT H2O évaporation H2O PLANT Different isotopic distribution H2O sol GROUND

SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT CLIMAT EFFECT high evaporation Low evaporation (D / H) faible (D / H) élevé

SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT SOL EFFECT eau eau sand clay

SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT PLANT EFFECT Isotopic fractionment generated by metabolism reactions

SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT PLANT EFFECT Inter molecular Isotopic fractionment generated by metabolism reactions Intra molecular

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT SNIF NMR NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT PLANT EFFECT Pour le deutérium GJ Martin, ML Martin Journal de Chimie Physique 1983,80,n°3

SNIF NMR FRACTIONNEMENT C4 C4 C4 C3

SNIF NMR FRACTIONNEMENT dD Blé (C 3) Mais (C 4) Environmental effect dC13 Metabolic pathway

THE PLANT IS FIXED (vine C3) THE MOLECULE IS FIXED (wine ethano) SNIF NMR WINE CARACTERISATION THE PLANT IS FIXED (vine C3) THE MOLECULE IS FIXED (wine ethano) CLIMAT The differences are related to PROCESS

SNIF NMR FRACTIONNEMENT Isotopic distribution for ethanol CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH CH3 - CHD - OH CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OD CH2D - CH2 - OH

Statistical distribution SNIF NMR Isotopic distribution for ethanol CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH Statistical distribution 3 2 1 Natural distribution

SNIF NMR MEASUREMENT

3 STEPS FOR WINE ANALYSIS SNI F NMR 3 STEPS FOR WINE ANALYSIS NMR ACQUISITION POSTPROCESSING SAMPLE PREPARATION

Extraction-purification SNIF NMR SAMPLE PREPARATION Extraction-purification WINE Rendement 100% ETHANOL DISTILLATION Alcool 95%

SNIF NMR MEASUREMENT TOOLS MASS SPECTROMETRY permet d ’obtenir le rapport isotopique global. Les produits à analyser sont préalablement transformés en H2O ou CO2 - sensible - précise

SNIF NMR MEASUREMENT TOOLS QUANTITATIVE NMR permet d ’obtenir le rapport isotopique de chacun des isotopomères (molécule mono substituée sur un des sites moléculaires) La méthode permet de connaître la répartition isotopique sur chacun des sites moléculaires et de mesurer les fractions molaires des différentes espèces isotopiques - peu sensible

SENSITIVITY IMPROVEMENT SNIF NMR QUANTITATIVE NMR SENSITIVITY IMPROVEMENT  High magnetic field (400 Mhz)  concentrated sample  15 mm tube diameter  average with a big number of scans  avoiding T1 saturation -TA >= 5* T1 - flip angle (90°,..)  broad band decoupling  lock system (F19)  avoiding NOE effect

NOE effect does not exist SNIF NMR Quantitative NMR deutérium électrons NOE effect does not exist nucleus Quadripolar momentum

ETHANOL DEUTERIUM SPECTRUM SNIF NMR ETHANOL DEUTERIUM SPECTRUM CH3—CH2--OH

RELATIVE ISOTOPIC RATIO SNIF NMR RELATIVE ISOTOPIC RATIO R = 3 I II / I III I II teneur isotopique du site méthylène I III teneur isotopique du site méthyle Dans une répartition statistique ---> R = 2 On constate un appauvrissement du site méthyle par rapport au site méthyléne

ACP,AFD,réseaux de neurones SNIF NMR STATISTICAL ANALYSIS G1 G2 variable X Y Z Z I n d i v u s 1 2 3 n SDM data G3 I2 Y NMR Data Y X Data Base Factorial analysis ACP,AFD,réseaux de neurones External data (climat,geology,…)

WINE CHAPTALISATION CONTROL SNIF NMR WINE CHAPTALISATION CONTROL Ethanolic fermentation Wine sugar distillation wine Éthanol Vine (,sol,climat) Sucre betterave canne

WINE CHAPTALISATION CONTROL SNIF NMR WINE CHAPTALISATION CONTROL (D/H en ppm) sugar CH2D CHD Beet(n=120) 90 (0.06) 122.4 (0.1) grape (n=130) 101 (0.08) 131 (0.1) cane (n=126) 109.6 (0.07) 119.9 (0.1) G J Martin, M L Martin Annual report on NMR Spectroscopy, Volume 31 1995

WINE CHAPTALISATION CONTROL SNIF NMR WINE CHAPTALISATION CONTROL sugar (%) T % en éthanol R chaptalisation(% sugar) 0 9.28 2.479 0.05 0.5 9.43 2.495 0.57 1 10.08 2.505 0.86 1.5 10.54 2.532 1.41 2 11.09 2.55 2.09 Détection 0.5%

WINE CHAPTALISATION CONTROL SNIF NMR WINE CHAPTALISATION CONTROL Wine isotopic composition is related to - wine fermentation process - vine climatenvironment Vin sec : influence négligeable du procédé de vinification car le mout initial est entièrement transformé ex blancs de Loire normal R= 2.522 chaptalisé R =2.594

Wine authentification SNIF NMR Wine authentification en O18, D, C13

WINE AUTHENTIFICATION x x x x x ? r r r R r

Measurement sensitivity improvement SNIF NMR QUANTITATIVE NMR PERPECTIVES : Measurement sensitivity improvement ERETIC (L Barantin, S Akoka) Magnetisation transfer (INEPT,DEPT) Extention to other product

SNIF NMR OTHER APPLICATIONS

ANETHOLES (natural et synthetic) SNIF NMR ANETHOLES (natural et synthetic) Axe Aromatique Axe éthylénique Axe méthylique

SNIF NMR VANILLINE L lignine G guaïacol N gousse de vanille

SNIF NMR NICOTINE

SNIF NMR Nicotine extraite de la feuille de tabac

LES OUTILS DE MESURE - RMN SNIF NMR LES OUTILS DE MESURE - RMN Elle est connue pour ses applications: - Imagerie médicale (anatomique, diagnostique, fonctionnelle) - Chimie structurale (élucidation des structures et conformation des macromolécules) - Analyse quantitative - faible sensibilité - grande spécificité - mise en évidence de faibles différences

 multiplication du signal d ’induction libre par une fonction SNIF NMR LA RMN QUANTITATIVE POST-TRAITEMENT DES SPECTRES  multiplication du signal d ’induction libre par une fonction exponentielle constante  correction de phase automatique  intégration entre des bornes définies  simulation et lissage des signaux

Détection de la chaptalisation et SNIF NMR Détection de la chaptalisation et caractérisation de l ’origine des vins La mesure de la répartition isotopique du deutérium sur la molécule d ’éthanol informe sur: - l ’environnement géo-climatique de la vigne (terroir). - le procédé de vinification.

LE FACTIONNEMENT NATUREL SPECIFIQUE SNIF NMR LE FACTIONNEMENT NATUREL SPECIFIQUE Il se produit aussi un fractionnement isotopique intra-moléculaire (la répartition intramoléculaire du deutérium sur les différents sites s ’écarte d ’une répartition statistique)

Observation d ’autres molécules (lipides) SNIF NMR PERSPECTIVES: Observation d ’autres molécules (lipides) Mesure du SNIF du C13 par RMN QUANTITATIVE les premiers résultats (B Zhang, S Akoka) sont encourageants

A temps d ’échantillonnage du signal SNIF NMR LA RMN QUANTITATIVE OPTIMISATION DE LA RESOLUTION SPECTRALE (Pour différencier des signaux voisins) F bande passante en Hz A temps d ’échantillonnage du signal N nombre de points(taille mémoire) la résolution R = 1/A le théorème de l ’échantillonnage impose 2.F.A = N F(Hz) Pour le deutérium par exemple F=600Hz N=16K R = 0.15Hz

- Le T1 est élevé (S/B diminue) SNIF NMR LA RMN QUANTITATIVE DEUTERIUM - CARBONE 13 Le C13 est un candidat moins bon que le deutérium pour l ’analyse isotopique par RMN quantitative - Le T1 est élevé (S/B diminue) - La large bande de fréquence rend le découplage Incomplet et difficile à réaliser - Il existe un effet NOE résiduel La gamme de variation des rapports isotopiques est réduite

SNIF NMR JM FRANCONI UMR 5536 / CNRS Université Victor Segalen 146 rue Léo-Saignat 33076 BORDEAUX CEDEX