La réplication d’acides nucléiques CHMI 2227F BiochImie i

Pourquoi étudier la réplication des acides nucléiques?

Parce que des fois ceci...

...nous mène ici! (Yikes!) http://www.scienceclarified.com/Ex-Ga/Fertilization.html

Pour grandir, le nombre de cellules doit augmenter Les cellules doivent dupliquer leur contenu Chaque division cellulaire donne lieu à deux cellules filles (bleue) Tout l’ADN doit être copié Les erreurs doivent être gardées au minimum (haute fidélité de réplication) Le taux de mutations est de 1 nucléotide/109 nucléotides (6.4x109 bp dans une cellule diploïde humaine) That translates into about 3 nucleotides changed every time the cell divides.

La réplication dans le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est le procédé ordonné de duplication cellulaire La réplication de l’ADN se produit seulement en phase S M phase: mitose G1 et G2: ‘gap’ périodes où la cellule se prépare pour l’étape suivante

Comment sont distribué les deux brins d’ADN après la réplication?

Distribution des brins d’ADN – les possibilités Différentes possibilités de distribution: 1 parental: 1 fille semi-conservateur (Watson-Crick) Parental et fille (conservateur) (Bloch) Briser l’ADN bicaténaire pour synthétiser les nouveaux brins (dispersive) (Delbrück) La théorie de Delbrück était qu’a chaque 10nt, le “backbone’’ d’ADN était brisé, le brin dupliqué, et ré-attaché. http://web.virginia.edu/Heidi/chapter30/chp30.htm

L’expérience Meselson-Stahl – préparation 14N (léger) est la forme la plus abondant d’N 15N (lourd) est fonctionnel et pas radioactif Centrifuge l’ADN extrait de colonies de E. coli sur un gradient CsCl, puis on prend une photo de l’absorbance UV The E. coli is grown for several generations on medium that contains 15N. Because it’s still functional, it gets incorporated into the DNA molecules. The samples are spun for 20h in the cesium chloride gradient, whose density increases to the right. What has the same density will end up together. Meselson M, Stahl FW. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli. PNAS Vol 44: 671-682

L’expérience Meselson-Stahl – les résultats Les générations sont mesurées après l’addition de 14N À génération 0: 1 bande À génération 1: 1 bande À génération 1.9: 2 bandes Pourquoi est-ce qu’il y a deux bandes à génération 1.9? Pourquoi est-ce qu’il y a 3 bandes quand on mélange 0 et 1.9?

Distribution des brins d’ADN Cette théorie est prouvée http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/DNAreplicationModes.png

Prérequis pour la synthèse d’ADN

Base pour la réplication d’ADN Pour pouvoir accomplir la réplication, le strict minimum requis: Les 4 désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) dATP, dTTP, dCTP, dGTP ADN matrice Amorce d’ADN/ARN pour commencer la réaction ADN polymérase

La réplication d’ADN La complémentarité des bases selon les règle de Watson-Crick L’hydrolyse donne lieu à un lien phosphodiester Relâche une molécule pyrophosphate (qui est aussi hydrolysé en phosphate, produit de l’énergie) Phosphates have a Pka near 0, so at pH 7, they are negatively charged. The repulsion of these large negative groups on the backbone moves the DNA bases inside, which allows them to form H bonds. These H bonds, and the hydrophobic interactions are enough to hold DNA together. Synthesis is driven by favourable energy expenditure = 1 pyrophosphate released is hydrolysed to 2 inorganic phosphates

Formation du lien phosphodiester 5’ 3’ 3’ Le nucléotide amène deux molécules de Mg2+ attaché au triphosphate Mg2+ se lieu au Asp de la polymérase (conservé) Le Mg2+ baisse l’affinité de l’oxygène pour l’hydrogène, et permet à la réaction de se produire Le groupement OH attaque le triphosphate de la base azotée Nature. 1998. 391:231-232

Synthèse d’ADN - polymérase The conversion of pyrophosphate to inorganic phosphate releases a large amount of free energy, and is therefore highly favourable state. Le nucléotide à ajouté doit être complémentaire à la matrice pour être reconnue par la polymérase L’ADN polymérase catalyse la formation du lien phosphodiester La processivité de l’ADN polymérase est le nombre de lien phosphodiester formé avant que la réaction ne cesse

Est-ce que les deux brins sont répliqué en même temps?

La réplication de l’ADN Par microscopie, on peut observer la réplication d’un plasmide Chaque fourche dans l’ADN est composé d’ADN parental et du brin répliqué Le point de départ s’appelle l’origine de réplication Les grosses molécules d’ADN peuvent avoir plus qu’une origine Figure 5-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

La fourche de réplication L’ADN est dénaturée La réplication se fait toujours 5’→3’ dans les organismes Une expérience avec 3H dans des bactéries a démontré la présence de molécules d’ADN de 1000-2000nt: les fragments d’Okazaki Fragments d’Okazaki dans eucaryotes: 100-200nt The daughter strand that is continuously replicated is termed the leading strand The opposing strand is called the lagging strand The polymerase requires the 3’ OH group in order to form the phosphodiester bond. Primers are needed to get replication started

Amorces pour le brin tardif À chaque 100-200nt (eucaryotes), une amorce est requise pour que la réplication se produise Les amorces sont synthétisées par l’ADN primase Les amorces sont à base d’ARN Ont une taille de 10nt

Réplication du brin tardif Les amorces d’ARN sont étendues par l’ADN polymérase III La polymérase III tombe du brin quand elle rencontre une structure bicaténaire ADN polymérase I efface l’ARN et la remplace par ADN ADN ligase forme les liens phosphodiester

Protéines spécifiques ont des fonctions spécifiques

Types d’ADN polymérases

Comment garder la polymérase sur l’ADN La polymérase ne reste pas sur l’ADN bien longtemps avant qu’elle ne « tombe » La pince coulissante (sliding clamp) garde la polymérase sur le brin d’ADN La pince est chargée sur l’ADN par le facteur de chargement (clamp loader) Le processus requiert l’ATP Dépend d’ATP! The quick dissociation is favourable for the synthesis of the Okazaki fragments which are short, but are not favourable for the synthesis of the leading strand which is continuous. The sliding clamp will dissociate as soon as it encounters dsDNA.

Polymerase – more than a protein... Pince coulissante

Le complexe se forme Chaque forme est une protéine distincte. Ensemble, elles forment le complexe appelé polymérase.

La correction d’erreurs ADN polymérase III a une activité exonucléase 3’→5’ Si les nucléotides ne sont pas complémentaires, il y a un transfert à la sous-unité d’édition Le mauvais nucléotide est enlevé (3’→5’) et la synthèse continue

La correction d’erreur...

ADN ligase ADN ligase Il manque un lien phosphodiester sur le brin d’ADN NMN: Nicotinamide Mononucleotide NAD: nicotinamide adenine dinucleotide Dans les bactéries: ligase dépend de NAD+ comme énergie Dans eucaryotes: la ligase dépend d’ATP

Délier l’ADN Pour être répliquée, la structure bicaténaire doit être ouverte Double hélix est très stable L’hélicase utilise l’ATP pour se propulser le long du brin Peut délier l’ADN à jusqu’à 1000bp/s DNA is very stable structure, and will not be unwound in steady state conditions – you need near water boiling point to denature the structure.

Garder l’ADN droit Des régions de complémentarité existent sur le brin délié Ces régions déstabilisent la polymérase Single-strand DNA-binding protein (SSB) stabilise le brin simple SSB ne recouvre pas les nucléotides, permettant la réplication

Où est le point de départ?

L’origine In E. coli: DnaA se lie à l’origine L’hélicase est DnaB Cette région est près d’une région riche en AT L’hélicase est DnaB La primase est DnaG

La fourche de réplication active

Putting it all together

Techniques

Séquençage d’ADN par Méthode de Sanger Chaque ddNTP est “coloré” à l’aide d’un fluorochrome de couleur différente

PCR Technique commune dans tous les labo de biochimie Après 25 cycles, la séquence génique est amplifiée 106 (2n =n est le nombre de cycles) Utilisé pour identifier des pathogènes lors d’infections, types de cancer, maladies génétiques, parmi bien d’autres... https://sites.google.com/a/luther.edu/genetics/students/tyler-best/pcr-amplification