Chromatographie en Phase Gazeuse CPG Licence Professionnelle Industries Chimiques et Pharmaceutiques Chromatographie en Phase Gazeuse CPG Enseignant : Y. FRANCOIS

Yannis FRANCOIS Laboratoire de Spectrométrie de Masse des Interactions et des Systèmes Tour de Chimie, 12ème étage e-mail: yfrancois@unistra.fr

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse quantitative Prétraitement de l’échantillon

Introduction chromatographie Historique 1900 : Invention de la chromatographie (Michel TSWETT) 1938 : Première chromatographie sur couches minces (Ismailov et Schraiber) 1952 : Naissance officielle de la chromatographie phase gaz (Martin et Synge, Nobel 1952) 1955 – 1960 : Age d’or de la chromatographie en phase gazeuse Fin des années 60 : Naissance de la chromatographie en phase liquide à haute performance De nos jours : Amélioration instrumentale (informatisation) et innovation dans le domaine de la miniaturisation (nanotechnologie)

Chromatographie d’élution Introduction chromatographie Principe Fraction Chromatographie d’élution

Introduction chromatographie Principe Séparation de mélange complexe Basée sur des équilibres particuliers entre les composés et deux phases : Phase stationnaire Phase mobile Différentes interactions peuvent entrer en jeu : Adsorption Partage Paires d’ions Échange d’ions Exclusion stérique

Introduction chromatographie Principe Affinité forte du produit pour la phase stationnaire : Le produit progresse lentement dans la phase stationnaire Le temps de rétention du produit est long Affinité forte du produit pour la phase mobile : Le produit progresse rapidement dans la phase stationnaire Le temps de rétention du produit est plus court Le temps de rétention du composé permet son identification

Introduction chromatographie Principe Amélioration technique permanente de la chromatographie : Miniaturisation et automatisation des systèmes d’injections Injection de petit volume Répétabilité des injections Grande variété de phase stationnaire Variation des types d’interactions Augmentation de la sensibilité des détecteurs Étude de traces

Introduction chromatographie Principe Colonne - Injection Détecteur Phase mobile

Introduction chromatographie Domaines d’applications De nos jours, la chromatographie est la technique de séparation la plus largement utilisée Techniques très répandues dans le monde industriel Très grand domaine d’applicabilité

Introduction chromatographie Domaines d’applications Industrie chimique : production, contrôle… Industrie alimentaire : corps gras, vins et spiritueux, bière, arôme… Industrie cosmétique et parfums Industrie pharmaceutique Energie : raffinerie de pétrole, gaz naturel, biomasse… Contrôle pollution : eaux, sols, atmosphère Exploration spatiale Police scientifique Recherche scientifique

Introduction chromatographie Les questions que vous aurez à vous poser ? Quel type d’échantillon ? Solide, liquide, gazeux Que veut on doser ? Composé majeur, mineur ou des traces Analyse partielle ou complète de l’échantillon ? Récupération de l’échantillon ? Précision de l’analyse ? Qualitatif ou quantitatif Durée de l’analyse ? Quel sera le coût de l’analyse ? Poids de l’analyse sur l’environnement ?

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse quantitative Prétraitement de l’échantillon

Aspect théorique Le chromatogramme Chromatogramme - Détecteur Colonne Injection Détecteur Chromatogramme Phase mobile

Aspect théorique Le chromatogramme tR tM tR’ tM : Temps mort tR : Temps de rétention t’R : Temps de rétention réduit

Coefficient de partage Aspect théorique Coefficient de partage CS : concentration dans la phase stationnaire CM : concentration dans la phase mobile

Grandeurs physiques : Temps Aspect théorique Grandeurs physiques : Temps tM tR tR’ tM (Temps mort) : temps écoulé pour un composé non retenu par la colonne tR (Temps de rétention) : temps écoulé entre l’instant de l’injection et le max du pic du composé t’R (Temps de rétention réduit) : temps de rétention affranchit des phénomènes hors phase stationnaire t’R = tR – tM

Caractéristiques de la courbe de Gauss Aspect théorique Le chromatogramme idéal Caractéristiques de la courbe de Gauss

de la phase stationnaire Composé trop peu retenu Aspect théorique Le chromatogramme réel Cas idéal Surcharge de la phase stationnaire Composé trop peu retenu Irrégularité de concentration dans la zone de dépôt Vitesse de la phase mobile non constante dans la colonne

Grandeurs physiques : Volume Aspect théorique Grandeurs physiques : Volume VM (Volume mort) : Volume de la phase mobile tM : tps mort D : Débit VM = tM . D Attention VM différent du volume de la colonne car il faut prendre en compte la porosité ε de la colonne VCol = Volume de la colonne = π . (d/2)2 VM = Volume mort = π . (d/2)2 . ε ε = 0,8 pour une bonne colonne

Grandeurs physiques : Volume Aspect théorique Grandeurs physiques : Volume VM (Volume mort) : Volume de la phase mobile tM : tps mort D : Débit VM = tM . D VS (Volume stationnaire) : Volume de la phase stationnaire VS = Vtot - VM Vtot : Vol. total interne VR = tR . D VR (Volume rétention) : Volume de la phase mobile qu’il faut faire passer pour faire migrer le soluté tR : tps rétention D : Débit

Grandeurs physiques : Facteur de rétention k’ Aspect théorique Grandeurs physiques : Facteur de rétention k’ Indépendant du débit Indépendant de la longueur de la colonne Définit le comportement des colonnes tR = tM(k’+ 1) k’ = t’R/tM

Règle générale : Facteur de rétention k’ Aspect théorique Règle générale : Facteur de rétention k’ k’ = 0 → tR = tM ou VR = VM Composé non retenu par la phase stationnaire k’ faible Composé peu retenu par la phase stationnaire tR rapide k’ très grand Composé très retenu par la phase stationnaire tR très grand k’ trop grand Composé trop retenu par la phase stationnaire Phénomène de diffusion, le pic s’élargit

Règle générale : Facteur de rétention k’ Aspect théorique Règle générale : Facteur de rétention k’ Ordre de grandeur de k’ : Compris entre 1 et 10 Le meilleur compromis : Analyse courte Bonne séparation 2 < k’ < 6 1 heures

Grandeurs physiques : la théorie des plateaux Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie des plateaux La théorie des plateaux est sans doute la meilleure théorie permettant d’expliquer les phénomènes de séparation chromatographique. Modélisation des équilibres Soluté/Phase stationnaire/Phase mobile sous la forme de plateaux. Limitations : Absence de considération des phénomènes de diffusion Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans un volume infiniment petit Absence de considération cinétique (vitesse d’échanges entre les deux phases) Théorie cinétique (Vu plus tard dans le cours)

Grandeurs physiques : Efficacité Aspect théorique Grandeurs physiques : Efficacité Paramètre N : Nombre de plateaux théoriques Paramètre H : Hauteur des plateaux théoriques H = L/N N : paramètre relatif, dépend du soluté et des conditions opératoires

Grandeurs physiques : Efficacité théorique Aspect théorique Grandeurs physiques : Efficacité théorique ω δ Dispersion d’un soluté dans la colonne et traduction sur le chromatogramme ou

Aspect théorique Grandeurs physiques : Efficacité réelle Pour comparer les performances de différentes colonnes, pour un même composé, on utilise le nombre de plateaux théoriques effectifs. t’R : tps réduit

Grandeurs physiques : Sélectivité α Aspect théorique Grandeurs physiques : Sélectivité α La mesure de la sélectivité d’une séparation entre deux composés est réalisée à l’aide du facteur de sélectivité α Le facteur de sélectivité α décrit la position, l’un par rapport à l’autre, de deux pics adjacents

Grandeurs physiques : Sélectivité α Aspect théorique Grandeurs physiques : Sélectivité α Le facteur de sélectivité α peut être exprimé à l’aide des paramètres de rétention : Avec les temps de rétention : Avec les volumes : α = (VR2 – VM)/(VR1 – VM) VR2 = VM + K2VS VR1 = VM + K1VS Or Ki = k’i . VM/VS

Grandeurs physiques : Résolution R ou Rs Aspect théorique Grandeurs physiques : Résolution R ou Rs Le facteur de résolution R permet de traduire numériquement la qualité de la séparation entre deux pics. La résolution

Pour une bonne séparation : Aspect théorique Exemple : Résolution R ou Rs Pour une bonne séparation : Rs > 1,5

Grandeurs physiques : Relation entre N et Rs Aspect théorique Grandeurs physiques : Relation entre N et Rs Pour deux pics homologues : Or

Grandeurs physiques : Relation entre Rs et α Aspect théorique Grandeurs physiques : Relation entre Rs et α Or Approximation : k’ = moyenne de k’1 et k’2 si les pics sont similaires ou presque

Que faire quand les pics sont mal résolus ? Aspect théorique Question : Que faire quand les pics sont mal résolus ? On augmente le facteur de rétention k’ On augmente l’efficacité N On augmente la sélectivité α

Aspect théorique Exemple appliqué à la CPG: Mauvaise séparation Séparation de deux composés A et B sur une colonne de 2 m : Calculer la résolution de la colonne ? Données expérimentales : tRA = 400 sec ωA = 19,5 sec tRB = 420 sec ωB = 20,5 sec tM = 50 sec R = 2.(420-400)/(19,5+20,5) = 1 Mauvaise séparation

Aspect théorique Exemple appliqué à la CPG: NB = 5727 plateaux Calculer le nombre de plateaux théoriques de la colonne ? Avec = 7,4 = 7 = 1,06 et = 0,06 NB = 5727 plateaux

Aspect théorique Exemple appliqué à la CPG: Quelle longueur de colonne serait nécessaire pour avoir R = 1,5 ? Application numérique : R2/R1 = 1,5/1 = 1,5 = y = 2,25 L2 = 2,25 . 2 m = 4,5 m

Grandeurs physiques : la théorie des plateaux Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie des plateaux La théorie des plateaux est sans doute la meilleur théorie permettant d’expliquer les phénomènes de séparation chromatographique. Pics gaussiens Calcul du nombre de plateaux Limitations : Absence de considération des phénomènes de diffusion Impossibilité d’introduire tout l’échantillon dans un volume infiniment petit Absence de considération cinétique (vitesse d’échanges entre les deux phase Causes d’élargissement des pics

Grandeurs physiques : la théorie cinétique Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique La théorie cinétique considère le pic chromatographique comme représentatif de la distribution statistique des temps de rétention des molécules d’une substance donnée sur la colonne. La théorie cinétique considère les phénomènes de diffusion et de transfert de masse

Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique Phénomènes de diffusion : Diffusion moléculaire longitudinale Diffusion turbulente Remplissage

Grandeurs physiques : la théorie cinétique Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique Transfert de masse a b t0, les molécules a et b d’une même substance sont sur la même ligne ti, a va rester dans le pore du grain de la phase stationnaire et b dans la phase mobile tf, b ira plus vite que la molécule a 2 heures

H = A + B/ū + C.ū Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique Application à la CPG Equation de Van Deemter H = A + B/ū + C.ū ū = vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile dans la colonne

Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique Les solutions pour minimiser des phénomènes de diffusion : Améliorer l’homogénéité de la phase: Absence d’hétérogénéités Absence de bulle Absence de vide Réduire le diamètre des particules dp Homogénéiser le débit de la phase mobile Diminuer la taille des grains et des pores

Grandeurs physiques : la théorie cinétique Aspect théorique Grandeurs physiques : la théorie cinétique En résumé : Prendre des particules De petites tailles De faible porosité Réaliser des chromatographies Rapides Avec des phases stationnaires miniaturisées Travailler A faible température En réduisant les volumes morts

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse quantitative Prétraitement de l’échantillon

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Principe Méthode de séparation de composés gazeux ou susceptibles d’être vaporisés dans décomposition A ÉCHANGE de molécule GAZEUSE entre phase stationnaire et phase mobile Phase stationnaire liquide ou solide Phase mobile GAZEUSE Phase stationnaire Phase mobile B

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Phase mobile ou gaz vecteur Nature : Gaz inerte Hélium Diazote Argon Dihydrogène… Propriété : inerte vis-à-vis des solutés et des phases stationnaires Choix du gaz vecteur Détecteur utilisé Coût de fonctionnement… Il n’y a pas d’interaction entre le gaz et la phase stationnaire Il n’y a pas d’interaction entre le gaz et les solutés

En CPG, on utilise des gaz de pureté 5.0 (ou N50) Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Pureté du gaz vecteur Impératif : Le gaz doit être d’une très grande pureté Référence A.0 (ou NA0), A indique le nombre de 9 présent dans le chiffre de pureté : 6.0 (ou N60) a une pureté de 99,9999% 3.5 (ou N35) a une pureté de 99,95% En CPG, on utilise des gaz de pureté 5.0 (ou N50)

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Phase mobile ou gaz vecteur La nature et la vitesse linéaire d’une phase mobile donnée, contribuent à la qualité de la séparation

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) La température T La température T est un paramètre majeur en GPG Le volume de rétention VR varie selon la loi : Log(VR) = (a/T) + b Si T augmente : le volume de rétention diminue et donc le temps de rétention diminue

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) La température T Représentation de l’équation pour une série de composés homologues Log(VR) = (a/T) + b Plus la température est forte, plus la séparation est rapide A très forte température, il n’y a plus de séparation

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) La température T Représentation de l’équation pour une série de composés différents A T1, on ne sépare pas les composés 1 et 3 A T3, on ne sépare pas les composés 1 et 2 A T2, on sépare des composés 1, 2 et 3

Paramètre important : Choix du gaz vecteur Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Relation entre gaz vecteur et température Paramètre important : Choix du gaz vecteur

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Appareillage 3 heures

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse quantitative Prétraitement de l’échantillon

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Appareillage

Systèmes d’injection ROLE : IDEAL : Interface échantillon-chromatographe Système de vaporisation Organe de transfert dans la colonne IDEAL : Récupération représentative de l’échantillon sans discrimination Permettre l’analyse quantitative Permettre l’analyse de traces Volume mort minimum, capacité suffisante Inertie chimique Répétabilité pour des injections manuelles Automatisation…

Systèmes d’injection Deux principaux types de colonne en CPG

Systèmes d’injection Choix du système Colonnes remplies Injecteur classique à septum Injection directe Injecteur automatique Vanne à gaz Injecteur à solides

Systèmes d’injection Choix du système Colonnes capillaires Injection directe Injection avec division (split injection) Injection sans division (splitless injection) Injection dans la colonne (on column) Injection à température programmée Injection à évaporation de solvant

Systèmes d’injection Boucle d’injection Entrée gaz vecteur Colonne 4 5 Poubelle Échantillon 3 4 5 6 1 2

Schéma d’un système d’injection Systèmes d’injection Schéma d’un système d’injection

Systèmes d’injection Injection direct Système de première génération Utilisé pour des colonnes remplies et des colonnes capillaires Limitation du volume injecté Variation du diamètre de l’insert suivant le type de colonne Grand diamètre pour colonnes remplies Petit diamètre pour colonnes capillaires Limitation du diamètre interne des colonnes capillaires (0,53 mm)

Systèmes d’injection Injecteur « direct »

Injection direct : Exemple Systèmes d’injection Injection direct : Exemple Cas des fortes concentrations : Pour une injection de 0,1 µL (minimum possible) d’un produit dont la concentration est de l’ordre de 10%, alors il y aura saturation d’une colonne capillaire Mauvaise efficacité, mauvaise séparation Cas des faibles concentrations : Volume d’échantillon limité par le volume de l’insert. Si l’on travail sur des traces et que le détecteur n’est pas sensible, alors le chromatogramme sera plat. Pas de séparation

Injection split/splitless Systèmes d’injection Injection split/splitless Système le plus répandu pour les séparation colonne capillaire Injection de volume d’échantillon compatible avec la quantité de phase stationnaire dans la colonne Split : système pour les échantillons très concentrés Utilisation d’une vanne de Split pour diviser le volume total injecté Réduction du volume injecté dans la colonne Splitless : système pour les échantillons très dilués Utilisation de la vanne de Split pour pré concentrer Pré concentration en tête de colonne

Injecteur Split/Splitless Systèmes d’injection Injecteur Split/Splitless

Systèmes d’injection Injection split/splitless Fonctionnement Split : Injection d’un volume total d’échantillon dans le liner à l’aide d’une seringue L’injecteur étant chauffé, l’échantillon est instantanément vaporisé L’échantillon est ensuite divisé en deux partie par une vanne de split La plus petite partie est injectée dans la colonne La plus grande est évacuée par ce que l’on appelle la fuite Rapport de division R = débit de fuite/débit de la colonne

Systèmes d’injection Injection split/splitless Exemple Split : Débit de l’injecteur : 52 ml/min Vanne de fuite : 50 ml/min On en déduit le débit de la colonne à 2 ml/min R = débit de fuite/débit de la colonne R = 50/2 = 25 Si on injecte 1 µL, alors on introduit 1/25 de µL dans la colonne

Injection split/splitless Systèmes d’injection Injection split/splitless Fonctionnement Splitless : La vanne de split est fermée On introduit l’échantillon (max 3µL) On attend quelques dizaines de secondes Refocalisation dans les premiers cm de la colonne On ouvre la vanne de fuite pour purger la chambre d’injection Application Splitless : Piège à froid Effet solvant

Systèmes d’injection Injection On column Particulièrement utilisée pour l’analyse de composés présentant une température d’ébullition élevée et à l’état de traces Pour les composés facilement dégradables Introduction directement dans la colonne sans vaporisation Vaporisation directe dans la colonne et progressive

Systèmes d’injection Injecteur On column

Systèmes d’injection Injection On column Avantage : Pas de discrimination et de dégradation thermique Pas de décomposition des substances fragile Pas de septum Limitation : Nécessite d’utiliser des solution diluées car on ne divise pas l’échantillon Pollution de la colonne par des échantillons non volatils Nécessité de dégarnir de phase stationnaire le début de la colonne Pas encore automatisé

Injecteur à aiguille de verre Systèmes d’injection Injecteur à aiguille de verre

Injection à aiguille de verre Systèmes d’injection Injection à aiguille de verre Avantage : Pré concentration de l’échantillon Quantité d’échantillon injectée aussi faible que l’on souhaite Pas de septum, pas de pic de solvant Les composés non volatils ne rentrent pas dans la colonne, il reste dans la seringue Limitation : Manipulation délicate Non automatique

Systèmes d’injection Type de liner

Systèmes d’injection Liner ou insert Chemisage de la chambre d’injection pour la rendre inerte Premier point de contact de l’échantillon avec le système analytique Permet de faire évoluer la qualité de l’injection Différents diamètres d’insert Possibilité de les modifier chimiquement Dérivation online des échantillons Grand nombre de liner proposé sur le marché Choix du liner idéal très compliqué (compromis) Possibilité d’activer ou de désactiver chimiquement le liner Augmentation du champs d’applications Entretient permanent du liner

Systèmes d’injection

Systèmes d’injection A B A B BON MAUVAIS Injecteur et entrée de colonne encrassés A B Injecteur et entrée de colonne nettoyés BON MAUVAIS

Systèmes d’injection Choix du liner Meilleure séparation Mauvaise séparation

Systèmes d’injection Insert non désactivé Insert désactivé 2,4,5,6-tétrachloro-m-xylène Endrin 4,4’-DDT Endrin aldehyde Methoxychlor Endrin ketone decachlorobiphenyl Insert non désactivé 62 % de décomposition de l’endrine Insert désactivé 1 % de décomposition de l’endrine

Systèmes d’injection Le septum 4 heures

Systèmes d’injection Le septum Le septum doit permettre l’injection et également assurer l’étanchéité du système Matériaux de confection : Facilité de perçage Bonne étanchéité Résistance thermique élevée Amélioration des séparations : Utiliser des septums comportant une phase teflon (inertie, temp. basses) Conditionner avant utilisation (étuve à 250°C)

Systèmes d’injection Le septum Durée de vie très variable. Elle dépend : De la température de l’injecteur De la forme et du diamètre de l’aiguille de la seringue Du degré de serrage Problèmes dus au septum: Fuite de la chambre d’injection Largage polymérique en tête de colonne Pic de solvant

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) Appareillage

Le four Elément essentiel aux chromatographes modernes car doit posséder une excellente stabilité thermique (jusqu’à 450°C) Homogénéité de la température assurée par un ventilateur Programmateur de température Doit chauffer et refroidir très rapidement Gradient de température pour pouvoir séparer en un minimum de temps des mélanges de composés peu volatils et très volatils

Le four Enceinte thermostaté Ventilateur Colonne

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La colonne Chromatographie d’adsorption Chromatographie de partage Gaz permanents, eau, gaz soufres, diols, glycols, amines légères Echantillon Mélanges complexes de solutés organiques de plus de 5 carbones Chromatographie de partage

La colonne Deux principaux types de colonne en CPG Les colonnes remplies Verre, métal Courte (1 à 15 m) et épaisse (1 à 4 mm) Les colonnes capillaires Silice fondue Longue (15 à 100 m) et très fine (100 à 250 µm)

La colonne Deux principaux types de colonne en CPG

La colonne Propriétés physiques

La colonne Différents types de colonnes capillaires Colonne usuelle dc = 0,25 à 0,32 mm Colonne macrobore gaz-solide (macrocapillaire) dc = 0,32 à 0,53 mm Colonne microbore (microcapillaire) hybride entre remplies et capillaires

Vitesse du gaz homogène tout au long de la colonne Colonnes capillaires Absence de remplissage Bonne répétabilité Possibilité de grandes longueurs Faible épaisseur de phase = grandes vitesses d’échange Analyse rapide Inconvénient : faibles volumes injectés Grande perméabilité des capillaires Diminution de la perte de charge A débit égal, il faut appliquer une pression de : 1 bar pour 100 m de capillaire 1 bar pour 1 m de colonne remplie Vitesse du gaz homogène tout au long de la colonne

Equation de Van Deemter La colonne : aspect théorique Equation de Van Deemter H = A + B/ū + C.ū Les colonnes remplies Les colonnes capillaires Equation de Golay H = B/ū + (CG + CL).ū CG : terme de transfert de masse en phase gaz CL : terme de transfert de masse en phase liquide

Paramètre important : Choix de la colonne Nature de l’échantillon Nature de la phase stationnaire Diamètre de la colonne Longueur de la colonne Épaisseur du film de la phase stationnaire Paramètre important : Choix de la colonne

Paramètres de choix de la phase stationnaire Film polymérique qui recouvre ou qui est greffé sur la paroi interne de la colonne capillaire Équilibres d’interactions entre solutés et phases différents suivant la nature de la phase Paramètres de choix de la phase stationnaire Nature Polarité Stabilité Température mini et maxi d’utilisation

Phase stationnaire : Polarité Composé non polaire Composé polaire

Phase stationnaire : Polarité

Phase stationnaire : Polarité Exemple 5 heures

Échelles de polarité Indices de rétention et constantes des phases Caractériser tout composé par une grandeur plus générale que le temps de rétention Suivre l’évolution des performances des colonnes Classer entre elles les phases stationnaires

Échelles de polarité Indices de rétention : Historique 1959 : Rohschneider Proposition d’une échelle de 0 à 100 entre le squalane (phase non polaire) et le ββ’-oxydipropionitrile 1959 : Wehrli et Kovats Mesure de la polarité d’une phase vis-à-vis de nombreuses fonctions chimiques en fonction d’une référence (n-alcanes) Obtention de l’indice de Kovats ΔI Théorie d’avant garde, mais trop complexe 1965 : Rohschneider Choisit 3 substances témoins : benzène, éthanol, méthyléthylcétone Mesure des indices de rétention sur la phase considérée et sur squalane Détermination de trois constante x, y, z

Toute les phases du commerces sont évaluées de cette manière Échelles de polarité Indices de rétention : Historique 1970 : Mac Reynolds Reprend la théorie de Rohrschneider en changeant la nature des composés test Constantes de Mc Reynolds 1970 : classement des phases imaginé par Mc Reynolds Évaluation de forces intermoléculaires majoritaires par les différences d’indices de rétention de 10 substances test Évaluation sur la phase que l’on veut classer Évaluation sur squalane Toute les phases du commerces sont évaluées de cette manière

Échelles de polarité Constantes de Mc Reynolds

Échelles de polarité Constantes de Mc Reynolds Exemple X’ sur OV17 = ΔI du benzène sur OV17 = I du benzène sur OV17 – I du benzène sur le squalane = 772 – 653 = 119 Constant de Mc Reynolds faible signifie que la phase retient sélectivement les fonctions chimiques du même type

Échelles de polarité Constantes de Mc Reynolds Les marques OV : Ohio Valley DB : JandW HP : Hewlett Packard CP-Sil : Varian

Échelles de polarité Constantes de Mc Reynolds

Échelles de polarité Constantes de Mc Reynolds

Choix de la colonne Nature de l’échantillon Nature de la phase stationnaire Diamètre de la colonne Longueur de la colonne Épaisseur du film de la phase stationnaire

Choix du diamètre Gain en temps d’analyse Perte en efficacité (N) et en résolution (R) Gain en capacité d’échantillon

Choix du diamètre

Choix de la colonne Nature de l’échantillon Nature de la phase stationnaire Diamètre de la colonne Longueur de la colonne Épaisseur du film de la phase stationnaire 4 heures

Influence de la longueur Plus la colonne est longue : Plus la résolution est améliorée Mais plus le temps d’analyse augmente Plus le cout de la colonne est important Exemple Avec une colonne de 60 m, on gagne 40% en résolution par rapport à une colonne de 30 m Avec une colonne de 60 m, on double le temps d’analyse par rapport à une colonne de 30 m La résolution augmente proportionnellement à la racine carrée de la longueur de la colonne

Influence de la longueur

Influence de la longueur

Choix de la colonne Nature de l’échantillon Nature de la phase stationnaire Diamètre de la colonne Longueur de la colonne Épaisseur du film de la phase stationnaire

Influence de l’épaisseur du film Les effets de l’épaisseur du film de phase et du diamètre interne de la colonne sont interdépendants Utilisation du rapport β pour sélectionner les colonnes : Plus la valeur de β est faible, plus la capacité et la rétention du composé sont élevées Application en fonction de β : Pour β < 100 - composés très volatils, masses faibles Pour β entre 100 et 400 - travaux courants, intervalles importants Pour β > 400 -masses moléculaires élevée

Influence de l’épaisseur du film

Choix de la colonne Vu la grande diversité de phase stationnaire, il est très important de faire le bon choix de colonne pour optimiser sa séparation

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Détecteurs ROLE : IDEAL : Appareil de mesure physico-chimique qui ne réagit qu’au passage des solutés voire d’espèces spécifiques du soluté Signal traité après amplification par un système informatique d’acquisition IDEAL : Sensible Rapport signal électrique/débit massique Rapport signal électrique/concentration Universel Robuste Domaine de linéarité large

Détecteurs 3 types de détecteur 2 types de réponse Les détecteurs universels Les détecteurs semi-universels Les détecteurs spécifiques 2 types de réponse Proportionnelle au débit massique Proportionnelle à la concentration du soluté dans la phase mobile

Détecteurs Comment choisir un détecteur ?

Le catharomètre Principe : On mesure la différence de conductibilité entre le gaz vecteur seul et le gaz vecteur chargé d’échantillon 6 heures

Le catharomètre Avantages et inconvénients: Premier monté sur des GC commerciaux Le plus universel Simple d’utilisation Considéré comme peu sensible Amélioration de la sensibilité grâce à la miniaturisation

Détecteur à ionisation de flamme (FID) Principe : Mesure le courant ionique généré dans une flamme hydrogène au passage de l’échantillon

FID Réponse Sensibilité Limite de détection Non proportionnelle au nombre d’atomes de carbone : à masse égale injectée, un C6 donne aprox. La même réponse qu’un C1 Le chlorure de méthylène donne une réponse moins grande que le méthane (le chlore refroidi localement la flamme) Sensibilité Très élevée, s’exprime en coulomb/gramme Limite de détection Peut atteindre 2 à 3 pg/sec

FID Avantages et inconvénients: Décrit la première fois en 1958 Le plus couramment utilisé Grande sensibilité Bonne linéarité Faible volume mort Presque universel Destructive

FID

FID alcalin (NDP) Principe : Comporte un petit cylindre en céramique dopé avec un sel alcalin (rubidium ou césium).

NPD Avantages et inconvénients: Grande sensibilité (de l’ordre de 0,1 pg) Bonne linéarité Faible volume mort Spécificité à l’azote (N) et au phosphore (P)

Photomètre de flamme (FPD ou SPD) Principe : Présence d’un tube photomultiplicateur qui converti les photons émis en un signal électrique

FPD Avantages et inconvénients: Présenté pour la première fois en 1966 Très grande sélectivité vis-à-vis des composés organiques soufrés ou phosphorés Pas universel

Détecteur à capture d’électron (ECD) Principe : Ionisation des analytes par des particules β émises par une source radioactive 63Ni Lorsque les analytes arrivent, ils seront ionisés par capture des électrons : A + e- → A- Lors du passage des analytes, le courant de base diminue Ce suivi de courant est traduit sous la forme d’un chromatogramme

(ECD) Avantages et inconvénients: Décrit par Lovelock en 1960 Détecteur très sélectif couramment utilisé Détecte les composés électronégatifs Très sensible pour les composés halogènés Détection des composés nitrilés, cyanés, polyaromatiques Insensible aux composés de type alcool et carbures saturés Très utilisé pour la détection des pesticides organochlorés Détecteur peu commun dans un laboratoire car présence de matière radioactive (norme et contrôle important)

Spectrométrie de masse Détermination de données structurales sur les composés

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse qualitative et quantitative Prétraitement de l’échantillon

Aspects qualitatifs L’aspect qualitatif d’une chromatographie consiste à identifier un composé Comparaison des temps de rétention avec ceux des standards Détermination des k’ et des α Indices de Kowats Méthode des surcharges Détecteurs sélectifs (Fluo, ECD, NPD,…)

Double assurance concernant la nature du composé détecté Aspects qualitatifs Si la comparaison avec les standards ne suffit pas : Certains détecteurs peuvent en plus fournir une information sur la nature du produit Spectrométrie de masse RMN Double assurance concernant la nature du composé détecté

Aspects quantitatifs L’aspect quantitatif d’une chromatographie consiste à identifier un composé et à le doser Pour un détecteur donné, on admet qu’il existe une relation linéaire entre l’aire d’un pic chromatographique et la quantité de composé responsable de ce pic La quantité de produit injecté dans la colonne se répartit sur toute la surface du pic chromatographique Avant, on découpait le pic et on le pesait De nos jours, on intègre la surface du pic (intégrateur)

Aspects quantitatifs Intégration du pic : Problème : on ne connaît pas la valeur du coefficient de réponse K qui lie la surface à la quantité injectée

Utilisation du technique d’étalonnage Aspects quantitatifs Comment faire pour doser un composé? Utilisation du technique d’étalonnage Étalonnage externe Étalonnage interne Technique des ajouts dosés …

Aspects quantitatifs Étalonnage externe Principe : On injecte des solutions étalons à différentes concentrations (encadrant la concentration de la solution à analyser) Aire Concentration Aire mesurée Composé inconnu Concentration Composé inconnu

Aspects quantitatifs Étalonnage externe Problèmes Il peut y avoir des problèmes de répétabilité du volume injecté la référence est indispensable et peut être indisponible dans le commerce Effets de matrice

Aspects quantitatifs Étalonnage par ajouts dosés Effet de matrice Mélange de A et B On veut doser A Le détecteur doit détecter A Mais B interfère car le détecteur détecte un peu B Alors on aura un signal correspondant à la quantité de A et un peu de la quantité de B Du coup, [A] sera surestimée A B A B A B B B A B A B Effet de matrice

Aspects quantitatifs Étalonnage par ajouts dosés Suppression Mélange de A et B Dopé en A On veut doser A L’échantillon est dopé en A (concentration connue) B interfère toujours Mais l’effet de B est réduit jusqu’à négligeable Du coup, [A] n’est plus surestimée A B A A A A A A A A A A Suppression Effet de matrice

Aspects quantitatifs Étalonnage par ajouts dosés Principe : Ajouter à une concentration inconnue mais constante, de notre composé des ajouts successifs de substance à analyser Aire [C] [C0] Ajout 1 Ajout 2 Ajout 3 ΔA

Solution : étalonnage interne Aspects quantitatifs Étalonnage interne Rappel : Le problème majeur de l’étalonnage externe est basé sur la non répétabilité de l’injection. Aire Concentration Résultat : Droite d’étalonnage non exploitable car non représentative Solution : étalonnage interne

Aire Eech/Aire Ei = f([Eech]/[Ei]) Aspects quantitatifs Étalonnage interne Nomenclature : Ei : étalon interne Eech : échantillon inconnue analysé ESt : échantillon standard Principe : Utiliser un Ei à une concentration fixe Optimiser la séparation des deux composés Ei et Eech Réaliser une droite d’étalonnage en faisant varier la concentration de l’ESt et en gardant concentration de l’Ei fixe Représenter la droite d’étalonnage : Aire Eech/Aire Ei = f([Eech]/[Ei]) Injecter le mélange contenant l’Ei et l’Eech Reporter la valeur mesurée sur la courbe et en déduire [Eech]

Aspects quantitatifs Étalonnage interne Dans la pratique : Solution mère ESt V1 V2 V5 V3 V4 1 mg/ml ESt 1 mg/ml Ei 2 mg/ml ESt 1 mg/ml Ei 3 mg/ml ESt 1 mg/ml Ei 4 mg/ml ESt 1 mg/ml Ei 5 mg/ml ESt 1 mg/ml Ei Solution mère Ei

Aspects quantitatifs Étalonnage interne ESt Gradient Concentration Résultat : Ei Concentration constante

[Eech] = (AEech/AEi).[Ei] Aspects quantitatifs Étalonnage interne Résultat : Aire ESt/Aire Ei [ESt]/[Ei] Aire Eech/Aire Ei [EEch]/[Ei] [Eech] = (AEech/AEi).[Ei]

Aspects quantitatifs Étalonnage interne Propriété de l’Ei : Structure chimique très proche Temps de rétention très proche Concentration très proche But de l’utilisation d’un Ei : Utiliser un rapport de concentration Corriger des erreurs de répétabilité de volume injecté 7 heures

Aspects quantitatifs Critère de qualité En analyse chromatographique comme pour d’autres techniques de mesure, le calcul statistique est incontournable Un résultat d’analyse n’a de valeur que s’il est assorti d’une estimation de l’erreur possible Pour être acceptable, une mesure doit être répétée : une exploitation statistique est alors possible

Bonne indication de la dispersion des résultats Aspects quantitatifs Critère de qualité Moyenne arithmétique x de n mesure : Écart type ou déviation standard : Coefficient de variation CV : Bonne indication de la dispersion des résultats

Aspects quantitatifs Critère de qualité La répétabilité s’exprime par l’écart-type des résultats d’essais indépendants entre eux obtenus sur le même échantillon avec la même méthode, dans un intervalle réduit de temps La reproductibilité s’exprime par l’écart-type des résultats d’essais indépendants entre eux obtenus sur le même échantillon avec la même méthode, avec des équipements différents et des opérateurs différent La précision c’est la dispersion des résultats autour de la moyenne. Elle est généralement exprimée par l’écart-type des mesures et correspond aux erreurs aléatoires La justesse c’est l’écart entre la moyenne des mesures et de la valeur réelle. Elle est généralement inaccessible et correspond aux erreurs systématiques La linéarité est la plage dans laquelle la réponse reste proportionnelle à la quantité soumise à l’analyse. Elle est représentée par une droite de régression de la forme : y = ax + b et la validité est exprimée par le coefficient de corrélation

Plan de cours Introduction générale sur la chromatographie Aspect théorique de la chromatographie Chromatographie gazeuse : principe et appareillage Introduction de l’échantillon : systèmes d’injections Colonnes Détecteurs Analyse quantitative Prétraitement de l’échantillon

Préparation de l’échantillon Préambule De nombreux échantillons ne sont pas injectables directement dans l’état dans le chromatographe Les sciences analytiques demande souvent un prétraitement de l’échantillon La préparation de l’échantillon peut être très complexe et représenter l’essentiel du travail de l’analyste C’est une science à part entière

Préparation de l’échantillon Techniques : Mise en solution Distillation Extraction Méthodes par adsorption Purge and trap SPE SPME Dérivation

Préparation de l’échantillon Mise en solution : Choix du solvant : Solubilité Absence de réaction chimique avec l’échantillon Pureté suffisante Inertie du solvant Formation de péroxydes Propriétés corrosives marquées (chlorés) toxicité

Préparation de l’échantillon Techniques : Mise en solution Distillation Extraction Méthodes par adsorption Purge and trap SPE SPME Dérivation

Préparation de l’échantillon Distillation : Distillation simple Évaporateur rotatif Distillation fractionnée Entraînement à la vapeur d’eau But: Séparer les volatils des non volatils Permettre de concentrer en éliminant les légers ou supprimer les lourds

Préparation de l’échantillon Techniques : Mise en solution Distillation Extraction Méthodes par adsorption Purge and trap SPE SPME Dérivation

Préparation de l’échantillon Extraction : Extraction classique par solvant Extraction par fluide en phase super critique (matrices solides) But: Extraire les composés sélectivement d’un mélange complexe Exemple : extraction de l’eugénol contenu dans le clou de gyrofle

Préparation de l’échantillon Techniques : Mise en solution Distillation Extraction Méthodes par adsorption Purge and trap SPE SPME Dérivation

Préparation de l’échantillon Méthode par adsorption : Adsorption des gaz Adsorption des liquides : extraction en phase solide SPE ou SPME But: Concentration de constituants mineurs d’une matrice gazeuse Extraction sélective des composés d’un mélange complexe Injection directe d’un composé dans un GC

Préparation de l’échantillon Adsorption des gaz On utilise un adsorbant spécifique placé dans un tube et l’on fait passer le gaz à l’aide d’une pompe (Exemple : Liner) Les adsorbants les plus utilisés : Tenax (polymère organique, hydrophobe, excellente stabilité thermique) Charbon actif : piégeage de polluants organiques variés dans l’atmosphère Le noir de carbone graphité : grande surface spécifique, piégeage gaz et composés très volatils Gel de silice et d’alumine : affinité pour les composés volatils polaires Remarque : Il est courant d’utiliser des cartouches mixtes avec divers adsorbants en série

Préparation de l’échantillon Adsorption des liquides : SPE Extraction en phase solide SPE : utilisation de cartouches ou disques remplis avec divers adsorbants Sert soit à concentrer, soit à simplifier la matrice La procédure répond au triangle d’équilibre entre : composé d’intérêt – matrice - adsorbant Composé d’intérêt adsorbant matrice

Préparation de l’échantillon SPE : Principe Similaire à la chromatographie en phase liquide On bloque certaines molécules sur un adsorbant et on les élue brutalement et sélectivement en les décrochant du support par un solvant spécifique

Préparation de l’échantillon SPE : procédure Première étape : conditionnement et solvatation Lavage avec un solvant adapté La cartouche ne doit plus être séchée Deuxième étape : équilibration Équilibration de la cartouche avec le solvant de l’échantillon Troisième étape : dépôt de l’échantillon Quatrième étape : élution Un solvant de polarité convenable est introduit dans la cartouche Permet selon le choix du solvant d’éluer les produits à isoler et retenir les interférents ou l’inverse

Préparation de l’échantillon SPE : procédure

Préparation de l’échantillon SPE : buts Isolation d’un composé d’un mélange complexe Concentration de l’échantillon Purification de l’échantillon Changement de solvant Les 4 objectifs à la fois

Préparation de l’échantillon SPE : matériel Cartouches en forme de seringues ou disques (capacité de 2,5 mg à 500 mg, volume d’élution de 125 µl à 25 ml) Corps en polypropylène ou en verre Fritté en polyéthylène Divers adsorvants Silice greffée Résines Florisil, alumine, carbone graphité…

Préparation de l’échantillon SPE : avantages Technique rapide, sélective et peu consommatrice de solvant Extraction d’un ou plusieurs composés d’une matrice complexe Enrichissement de traces (préconcentration) Dessalage de solutions Dérivatisation en ligne Grande variété d’adsorbants

Préparation de l’échantillon SPE : guide de choix Matrice aqueuse : composés d’intérêt Apolaires : phase apolaire Ionisables basiques : résine échangeuse de cations Ionisables acides : résine échangeuse d’anion Non ionisables polaires : SPE non adaptée

Préparation de l’échantillon SPE : guide de choix Matrice organique apolaire : composés d’intérêt Polaires : phase polaire Moyennement polaire : phase polaire Apolaires : SPE non adaptée

Préparation de l’échantillon Microextration en phase solide : SPME Utilisation d’une seringue spéciale comportant une aiguille creuse dans laquelle coulisse une fibre en silice fondue recouverte d’une fine couche de phase stationnaire Adsorption d’un composé d’intérêt sur cette fibre Extraction sélective 8 heures

Préparation de l’échantillon Microextration en phase solide : SPME Fibre peut être utilisée soit en immersion soit en espace de tête Fibre ensuite désorbée directement dans l’injecteur du GC Domaines d’applications innombrables Évite l’utilisation de solvants Fibre réutilisable

Préparation de l’échantillon Microextration en phase solide : SPME

Préparation de l’échantillon Microextration en phase solide : SPME Méthode de l’espace de tête Analyse constituants volatils d’un échantillon lorsqu’il n’est pas souhaitable d’introduire l’ensemble de l’échantillon dans la GC

Préparation de l’échantillon Techniques : Mise en solution Distillation Extraction Méthodes par adsorption Purge and trap SPE SPME Dérivation

Préparation de l’échantillon Dérivation : But: Rendre les constituants d’un mélange moins polaires et plus volatils en les dérivants chimiquement Les réactions les plus courantes : Silylation Alkylation Acylation

Préparation de l’échantillon Dérivation : Silylation Sur fonctions alcool, phénol, amine. Substitution d’un groupe triméthylsilyle (TMS) à un atome d’hydrogène mobile Acylation On remplace un hydrogène mobile par un groupement acyle (obtention d’un ester) Alkylation Remplacement d’un hydrogène mobile par un radical alkyle, en générale un méthyle