La réplication de l’ADN Biog6L09 2008-2009 Paule SEITE Responsable UE Thierry FERREIRA

Watson et Crick 1953 « Il n’a pas échappé à notre attention que l’appariement de bases spécifiques dont nous faisons l’hypothèse, suggère immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique »

3 hypothèses Watson et Crick Delbrück Coupures/jonctions

Expérience de Meselson et Stahl, 1958 E Coli 15NH4Cl 14NH4Cl Transfert Cl : Réplication semi-conservative

La réplication est un mécanisme cellulaire vital Réplication E.coli (5x106 pb) ≈ 40 min Deux milles paires de bases à chaque seconde. L'ADN étant composé d'une dizaine de paires de bases par tour d’hélice, ce processus imprime un mouvement rotatif de 12000 rpm ! Comment ça marche? La survie d’une espèce dépend de sa stabilité génétique. Environ 1 nt modifié tous les 109 nt à chaque réplication. Pourquoi si peu d’erreurs?

Quel mécanisme moléculaire permet une réplication aussi rapide et efficace de la molécule d’ADN, compte-tenu des contraintes topologiques liées à la structure en double hélice ? Différentes suggestions : Super-enroulement inverse de celui de l’hélice Hélice droite en proportion égale d’hélice gauche Remise en cause de la structure double-hélice : rubans alignés (1976) Mais Incompatibles avec les données en diffraction RX

Le mécanisme de réplication dépend de 2 activités fondamentales Séparation des brins de la molécule mère Synthèse d’ADN Le mécanisme de réplication se déroule en 3 phases: Initiation Elongation Terminaison Ces activités impliquent des complexes protéiques qui agissent afin d’assurer une synthèse Progressive Coordonnée Couplée

Séparation des brins de la molécule mère ou comment se soustraire des contraintes topologiques? Les Topoisomérases 30 millions de tours/ chromosome en moyenne Découverte des topoisomérases (J. Wang, 1971). Coupures temporaires permettant de passer 1 ou 2 brins de la double hélice, puis religature des brins coupés. Type Substrat Exemple IA ADN ss Topo I et III (E.Coli) Topo III (Homme Levure) IB Topo I (eucaryotes) II ADN ds Topo II (gyrase) et IV (procaryotes) Topo II et IV (eucaryotes)

Modélisation Topo I Cap Core subdomain II Core subdomain I Linker Cter domain Core subdomain III

Mécanisme d’action de la Topo I

Modélisation Topo II

Mécanismes d’action de la Topo II

Les topoisomerases : - Modifient la topologie de l’ADN mais - Ne déroulent pas l’hélice (pas de rotation) - Diminuent le nombre de tours de la molécule mère Sont impliquées dans d’autres mécanismes moléculaires - transcription - recombinaison - constituant majeur de la matrice nucléaire - structure de la chromatine - séparation des chromatides au cours de la division

Initiation de la réplication et protéines associées Protéines d’initiation Hélicase Protéines SSB

Mécanisme de réplication chez E.Coli Réplicon : unité d’ADN où se produit la réplication. 1 origine 1 terminaison Chromosome bactérien = 1 replicon

La réplication est bidirectionnelle

Initiation de la réplication chez Coli OriC Unique 245 pb Caractérisées par la présence de séquences répétées en tandem - 3 séquences de 13 nucléotides de type GATCTNTTNTTTT (AT riche) - 5 sites de liaison (TT(A/T)T(A/C)CA(A/C) A) pour dnaA dnaA est une protéine d’initiation Copies multiples associées à OriC Consommation d’ATP Transformation localisée de l’ADN superenroulé(-) en ADN simple brin ADN ds ADN ss

Dna A : dénaturation localisée dnaBC : complexe de pré-amorçage Liaison de dnaB au site d’initiation Libération de dnaC (transporteuse) dnaB : Rupture des liaisons H dnaB catalyse le déroulement en présence d’ATP dnaB est une hélicase

Activité hélicase

Les protéines SSB empêchent le réappariement des brins Structure en feuillet b : canal autour du simple brin

Elongation

Réplication Réparation Détection des dommages Les ADN polymérases d'Escherichia coli Enzyme   ADN polymérase I ADN polymérase II ADN polymérase III Nombre de sous-unités 1   8 Fonctions Réplication Réparation Détection des dommages Réplication Polymérisation 5'®3' + + (a) Exonucléase 3'®5' + (e) Exonucléase 5'®3' -

Contraintes de fonctionnement de l’ADN Pol III 1) Sens de synthèse 5’ vers 3’ 2) Pas de synthèse possible sur une molécule simple brin Amorces indispensables

3) La fourche de réplication est asymétrique Brin précoce ou avancé : synthèse continue Brin tardif ou retardé : synthèse discontinue

Synthèse du brin avancé

ADN Pol III 8 sous unités a, e, θ : activité catalytique b: sliding clamp = pince 3g, d, d’ : clamp loader = attachement au brin et détachement

Synthèse du brin retardé

Polymérase de 5’ vers 3’ jamais isolée dTTP marqué au 3H Réplication pendant très peu de temps Extraction d’ADN Analyse des ADN simples brins radioactifs fragments longs sur un brin dit précoce fragments courts sur le brin tardif

ARN Polymerase ou primase Fragments d’Okasaki 3’ 5’ 3’ 5’ ARN Polymerase ou primase N’a besoin que d’une matrice Amorce ARN de 4 à 15 nt chez Coli ADN Polymerase III

Elimination des amorces ADN Pol III ADN Pol I Pol III sans activité exonucléasique Ligase

DNA synthesis at a replication fork 4 3 1 2

Initiation de la réplication chez les Eucaryotes Levure : Séquences ARS (séquences de replication autonome) ≤ 200pb, 4 sous domaines : A, B1, B2, B3 A B2 B3 B1 Reconnaissance de l’origine. Liaison ATP dépendante du complexe ORC (ori recognition complex). Stable. Liaison de ABF1 Torsion hélice Zone de fusion

Séquence de liaison au complexe ORC Séquence indispensable à l’activité de l’origine Unités transcriptionnelles ou séquences régulatrices Droso :Amplification Control Element et Amplification Enhancing Region (AT rich)

2 cas de figure chez les Métazoaires Origine localisée sur qques Kb (b globine) Région d’initiation où plusieurs séquences influencent l’activité de l’origine (DHFR)

La réplication n’est initiée qu’une fois par cycle cellulaire Zone de compétence

Contrôle de l’initiation de la réplication Origines rendues « compétentes » pour le recrutement des facteurs nécessaires à l’entrée en phase S. 2) Contrôle en fin mitose /début G1, pour 1 réplication unique à partir de chaque origine (sinon ….erreurs) 3) Liaison sur Ori de protéines ORC, qui ensuite recrutent autres facteurs pour former des complexes pré-replicatifs

En fin de G1 : Assemblage du complexe pré-réplicatif 1: ORC : origin recognition complex. 6 ss-unités 2: Fixation de cdc6: ATPase 3: Complexe hexamérique MCM2-7 Rôle régulateur important. Activité ATPase et hélicase Cdt-1 : Facteur de transcription

1: kinase cdc7 active le complexe réplicatif. Activité dépendante du facteur Dbf4 2 : CDK2 permet l’activation de cdc45 pour l’accrochage de l’ADN polymerase. Activité dépendante des cyclines

Régulation des complexes pré-réplicatifs 3: En anaphase, la geminine est dégradée 4: CDT1 est libérée et permet l’association des complexes pré-réplicatifs. 1: La geminine synthétisée en G1 se fixe sur Cdt1 2: Cdt1 est bloquée pour éviter l’association de nouveaux complexes PR.

Elongation

a b d e g 5’ > 3’ - + Les ADN polymérases d'Eucaryotes (9 ou +) I Supérieurs a b d e g Levure I IV III II mito z Sous unités 4 1 2 Localisation Noyau ? Fonction Amorçage replication Réparation replication Synthèse/lésion Polymérisation 5’ > 3’ Exonucléase 3’ vers 5’ - + 5’ vers 3’

(Clamp loader) se lie à l’ARN et recrute PCNA 4: Replication Factor C (Clamp loader) se lie à l’ARN et recrute PCNA 2: Replication Protein A (SSB) Polymerase switching 5: PCNA clampe Pold sur l’ADN 3: Synthèse d’une amorce hybride ARN-ADN (10nt) 6: Elongation par Pold sur brin retardé Pol e sur brin avancé 1: activité hélicase de Mcm 2-7 7: élimination de l’ARN par un complexe RNAseH/FEN(1nt)

Reconstitution de la chromatine Histones restent attachées à l’ADN Addition de nouvelles histones en arrière de la fourche de réplication CAF : facteurs d’assemblage de la chromatine

Cas particulier Réplication des Molécules linéaires

? Raccourcissement à chaque cycle de réplication Extrémité de la molécule D’ADN 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Raccourcissement à chaque cycle de réplication 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

Les télomères sont des séquences répétées (≈qques 100 aines) de petite taille (minisatellites 5’-TTAGGG-3’) situées aux extrémités des chromosomes eucaryotes. La longueur des télomères décide de la durée de vie des cellules. Après plusieurs divisions : sénescence. Cellules arrêtées dans leur cycle, puis éliminées. Sauf : cellules embryonnaires cellules souches (progéniteurs) cellules germinales

Longueur des télomères et nombre de réplications Chez S. cerevisiae Chez l’homme, les fibroblastes font 60 divisions

Aspect des extrémités chromosomiques dans les cellules différenciées T-Loop

Élongation par recombinaison T-Loop Cellules différenciées Forme inaccessible = closed Télomérase Élongation par recombinaison Forme accessible = open Cellules germinales Cellules souches intestinales hepatiques hematologiques