Small self-RNA Generated by RNase L Amplifies Antiviral Innate Immunity Krishnamurthy Malathi, Beihua Dong, Michael Gale Jr & Robert H. Silverman Nature, August 2007

L’immunité innée antivirale est initiée par des petits ARN générées dans les cellules infectées. Ces ARN activent des cascades de signalisation aboutissant à l’activation des gènes qui codent pour IFN- α et IFN- β. 2 récepteurs impliqués dans cette signalisation: - RIG-I (DDX58) – Retinoic acid Inducible Gene-I - MDA5 (IFIH1) – Melanoma Differentiation Associated Gene-5 CARDDExD N-ter C-ter MDA5 et RIG-I interagissent avec un récepteur mitochondrial: - IPS-1 (MAVS, VISA, Cardif) – Interferon-β Promotor Stimulator IPS-1 transmet les signal à des facteurs de transcription: - IRF-3 Interferon Regulatory Factor 3 - NFkB - Nuclear Factor-kappa B

Cascades de signalisation bien connues Origine des ARN qui les initient inconnue Hypothèse : Les ARN initiateurs sont dus à l’action de la RNase L, elle-même activée par l’acide adenylique ( 2'-5‘) RNase L – ribonucléase, produite en petites quantités pendant le cycle cellulaire sous forme inactive La présence d’ARNdb dans le cytoplasme stimule la production de acide adenylique (2’-5’) par la 2'-5' oligo(A) synthétase activation de la Rnase L

Effet de la RNase sur la production de IFN-β - Transfection de fibroblastes embryonnaires de souris wt et Rnase -/- avec le trimer 2-5A inactif (déphospphorylé) et actif (triphosphorylé). Seules les cellules wt transfectées avec l’oligonucléotide activé montrent des taux d’IFN-β significativement supérieurs à ceux des cellules contrôle Cette activation est dose dépendante ELISA

Traitement de cellules wt et RNase -/- par du Poly (I)·Poly(C) (dsRNA polyriboInosinic polyriboCytidylic acid - adjuvant synthétique utilisé in vitro pour la stimulation de la production d’IFN) Activation des fibroblastes wt dose dépendante Production d’IFN dans les cellules RNase -/- non activable

Infection de fibroblastes murins wt et RNase -/- par le paramyxovirus SeV (Sendai Virus) Production d’IFN-β nettement moins importante par les cellules mutées

Transfection de fibroblastes wt, RIG-I -/-, MDA5 -/- et IPS-1 -/- par l’oligonucléotide 2-5A Activation très faible ou inexistante de la production de IFN-β dans les fibroblastes délétés pour un des très récepteurs impliqués dans la cascade de signalisation induite par des petits ARNdb

Validation des résultats sur des cellules humaines Inhibition de l’expression d’un des récepteurs RIG-I, MDA5 et IPS-1 dans des cellules de cancer de prostate (DU145) par des ARNi La non expression d’un des trois récepteurs empêche l’activation de la production de IFN- β

Activation de la production de IFN-β par l’oligonucléotide 2-5A dans des cellules de cancer du fois HUH7 – Human Hepatoma cell line HUH7.5 – présentent une mutation dans le gène RIG-I Baisse de 28% de l’activation de la production de IFN-β dans les cellules HUH7.5 par rapport aux cellules HUH7

Action de la Rnase L sur des extraits d’ARN totaux en présence de l’oligonucléotide 2-5A. ARN cellulaires totaux de fibroblastes de souris déficients en RNase L, incubés avec de la RNase L recombinante et 2-5A. Seuls les ARN traités par la RNase recombinante en présence de 2-5A induisent une forte production de IFN-β dans des fibroblastes wt. Les ARN du soi sont capables d’activer le gène de l’IFN- β FRET + RNA chips

Seuls les ARN traités par la RNase recombinante en présence de 2-5A induisent une forte production de IFN-β dans des fibroblastes wt. Les ARN déphosphorylés ont un pouvoir inférieur de stimulation de la production d’IFN- β Les ARN phosphorylés en 3’ générés par la RNase L activent le mieux la cascade de signalisation

Effet de l’infection virale de souris wt et RNase L -/- sur la production d’IFN-β Infection par EMCV (EncephaloMyoCarditis Virus) Infection par SeV (Sendai Virus) Faible production d’IFN-β par les souris déficientes en RNase L

Induction de la production d’IFN-β in vivo par injection de souris non infectées par un virus avec l’oligonucléotide 2-5A Des ARN du soi issus de l’action de la RNase L sont également capables d’induire la production de IFN-β dans des cellules non infectées.

Des petits ARNdb viraux ainsi que des ARN du soi produits pas la RNase L sont capables d’activer la synthèse d’IFN-β via la cascade RIG-I, MDA5, IPS-1 Ces ARN sont en général des duplex car la RNase L coupe des régions simple brin Les ARN du soi générés par la RNase L amplifient le signal et la réaction du système immunitaire inné contre les infections virales L’IFN-β ainsi produit stimule d’avantage la cascade RIG-I, MDA5, IPS-1 Beaucoup de virus possèdent des mécanismes d’inhibition du récepteur RIG-I des stratégies de stimulation de l’activité de la RNase L pourraient avoir des applications thérapeutiques CONCLUSION