Introduction – Thérapie génique 09/09/2004 José CORTES
Mise au point d’une technique de cartographie à haut débit des sites d’intégration d’un vecteur rétroviral 09/09/2004 José CORTES
Introduction – Essai clinique d’Alain FISHER 09/09/2004 José CORTES 11 enfants atteints de X-SCID Cependant 2 enfants ont développé une Leucémie
Introduction – Etudes des sites d’intégrations (1) 09/09/2004 José CORTES L’équipe de Bushman Virus HIV-1 : Intégration préférentielle au niveau de gènes transcriptionnellement actifs L’équipe de Burgess Vecteurs HIV-1 : Intégration préférentielle à l’intérieur de l’unité transcriptionnelle. Vecteurs MLV : Intégration préférentielle aux alentours du +1 de la transcription.
Introduction – Etudes des sites d’intégrations (2) 09/09/2004 José CORTES Technique utilisée : Vecteur ou VirusADN génomique Digestion enzymatique (site de coupure fréquent) Ajout d’adaptateurs PCR Nested PCR Clonage et séquençage
Introduction – Objectif de mon stage 09/09/2004 José CORTES Réalisation de la technique
Résultats – 1ère partie (1) 09/09/2004 José CORTES Analyse des jonctions vecteur-ADN génomique NlaIII 5’ MmeI catg PVI Partie Vecteur Côté Reverse Séquence à analyser PLI3 Côté Universel Séquence cible de l’insertion Site d’insertion du vecteur schéma d’un contig réalisé par le logiciel BioEdit
Résultats – 1ère partie (2) 09/09/2004 José CORTES 211 clones bactériens séquencés
Résultats – 1ère partie (2) 09/09/2004 José CORTES 182 jonctions Sur 117 jonctions positionnables sans ambiguïté, 111 jonctions sont différentes.
Résultats – 1ère partie (3) 09/09/2004 José CORTES Positions des insertions détectées sur leurs chromosomes respectifs D’après le site Les traits rouges représentent la position des intégrations détectées Les chromosomes encadrés en rouge n’ont subit aucune modification par le vecteur
Résultats – 1ère partie (4) 09/09/2004 José CORTES
Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES 102 pb pb 44 pb 30 pb bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 58 pb pb 20 pb
Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 100 pb 20 pb : PCR bPLN/bPLI 2 : Fragment digéré par NlaIII4 : Fragment de 26 pb purifié 3 : Purification sur billes Puits n°4
Résultats – 2ème partie (1) 09/09/2004 José CORTES bPLI bPLN PCR bPLN/bPLN NlaIII Digestion NlaIII Ligation LN2 NlaIII 5’ NlaIII 5’ MmeI Digestion par MmeI NlaIII MmeI 500 pb 1000 pb région pb
Résultats – 2ème partie (2) 09/09/2004 José CORTES Analyse des concatémères NlaIII
Résultats – 2ème partie (3) 09/09/2004 José CORTES Étiquettes obtenues : Sur 40 séquences de concatémères, 1002 étiquettes on été extraites. Moyenne de 25 étiquettes par concatémère
Résultats – 2ème partie (4) 09/09/2004 José CORTES Comparaison des étiquettes sur le génome
Résultats – 2ème partie (5) 09/09/2004 José CORTES Comparaison des étiquettes sur le génome
Résultats – 2ème partie (5) 09/09/2004 José CORTES
Conclusion 09/09/2004 José CORTES Objectif atteint 211 séquences -> 111 jonctions différentes sur le génome 40 séquences de concatémères -> 207 étiquettes différentes, positionnables sans ambiguïté sur le génome
Remerciements 09/09/2004 José CORTES Olivier DANOS Équipe Ciblage Javier PEREA Nathalie HOLIC-BARLET Julie MANTOVANI Service Séquençage Sabine Dubus Service Informatique Kelly MARTINEZ Aux Généthoniens…