Boiningénierie de l’ADN CHMI 3216 E Semaine du 14 Septembre 2007 Boîte à outils, 2ième partie. Plasmides, clonage d’ADN 101 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides Plasmides: Molécules d’ADN circulaires extrachromosomales Caractéristiques de base: Origine de réplication: permet au plasmide de se répliquer de manière autonome; Gène de résistance à un antibiotique: permet la sélection de bactéries possédant le plasmide; Site de clonage multiple (multiple cloning site -MCS): une petite région du plasmide crée en laboratoire et contenant un certain nombre de sites de coupure uniques pour des enzymes de restrictions. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – origine de réplication Origine de réplication (Ori): courte séquence d’ADN permettant à l’ADN polymérase bactérienne de lier et initier la réplication du plasmide; Il existe plusieurs types d’Ori. ColE1 celui rencontré le plus souvent; Certaines Ori permettent au plasmide de se répliquer fréquemment (plasmides à nombre de copies élevées – jusqu’à 100 copies par bactérie); d’autres Ori ne permettent qu’un taux relativement faible d’initiation de la réplication (plasmides à nombre de copies faible– seulement quelques copies de plasmide par bactérie); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – gènes de sélection Gènes codant des protéines permettant la résistance bactérienne à un antibiotique particulier; Gènes le plus souvent rencontrés: Ampr: résistance à l’ampicilline Kanr: résistance à la kanamycine Tetr: résistance à la tétracycline Les bactéries possédant un plasmide ayant le gène Ampr seront capable de survivre lorsque cultivées dans un milieu de culture contenant de l’ampicilline; E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – sites de clonage multiples MCS: une région limitée du plasmide crée artificiellement et qui possède plusieurs sites de coupure uniques pour un ensemble d’enzymes de restriction; Les sites de restriction retrouvés dans le MCS ne sont pas retrouvés ailleurs dans le plasmide en question. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – autres caractéristiques Promoteurs pour les ARN polymérases virales Sp6, T7 or T3 Permet de faire des expériences de transcription in-vitro; Origine de réplication du phage F1: Permet la préparation de plasmides simple-brin; Gènes codant pour des ARNt suppresseurs Gènes indicateurs (reporter genes): Permettent l’identification rapide et simple de colonies bactériennes possédant des propriétés particulières; P.ex..: Lac z (code la b-galactosidase); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – Gène de sélection SupF ARNt suppresseur Insère l’ acide aminé Glu au codon stop UAA; Permet la survie de bactéries possédant un épisome (plasmide naturel) P3: l’épisome P3 possède les gènes de résistance Ampr et Tetr interrompus parle codon stop UAA. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

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Plasmides – pBR322 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides - pBluescript E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – vecteurs navette Les vecteurs navette peuvent être utilisés dans au moins deux organismes vivants différents: Bactéries (obligatoire) Levures Insectes Plantes Mammifères E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Plasmides – Vecteurs navette Vecteur navette pour bactérie/levures; Leu2: Gène de sélection pur la croissance chez la levure; Code pour un gène permettant la synthèse de l’acide aminé Leu dans des cellules de levures incapables de produire la Leu par elles-mêmes (auxotrophe); Les levures possédant ce vecteur pourront croître dans un milieu de culture ne contenant pas la Leu. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Clonage d’ADN Pourquoi cloner l’ADN? Obtenir de grandes quantités Caractériser les propriétés spécifiques à un ADN particulier: Séquence Mutagenèse Pour exprimer une protéine spécifique in vitro ou dans une organisme vivant: P. ex: production d’insuline recombinante: mieux que l’insuline purifiée du sang, qui peut être contaminée par des virus (hépatite, HIV) ou autres belles petites choses (prions); E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Clonage d’ADN – Étapes de base 1. Coupe l’ADN d’intérêt et le plasmide avec un enzyme de restriction approprié; 2. Mélange les deux ensemble et soude les bouts libres avec l’ADN ligase (ligation) 3. Insère l’ADN/plasmide (plasmide recombinant) dans des bactéries (transformation) Requiert l’utilisation de bactéries compétentes. 4. Sélection des bactéries résistante à un antibiotique et recherche des bactéries possédant le fragment inséré dans le plasmide. 5. Confirmation du clonage Digestion par enzyme(s) de restriction Séquençage E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Clonage d’ADN – Étapes de base http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/plasmid.html E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Clonage d’ADN Traitement du vecteur à la phosphatase alcaline: Permet de réduire le bruit de fond (background) de bactéries possédant le plasmide n’ayant pas incorporé le fragment d’intérêt. Des bouts francs peuvent être utilisés pour le clonage (un rapport fragment d’DNA/plasmide devra être plus élevé: 10/1 au lieu de 3/1) Les bouts de l’ADN d’intérêt peuvent être modifiés par la Klenow afin d’accommoder les sites de restriction disponibles sur le vecteur (et vice-versa). L’utilisation d’adaptateurs et linkers peut faciliter grandement le clonage. E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Adaptateurs et linkers E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009

Devoir #2 E.R. Gauthier, Ph.D. CHMI 3216 F – A2009