2) Le zebrafish (poisson zèbre) - Temps de génération : 3 mois - 50 à 300 embryons / ponte  approches génétiques (mutants et transgéniques) -Fécondation et développement externe  Observations et micromanipulations aisées + « clareté » des embryons

Le génome du zebrafish - 25 chromosomes (tous autosomes ! Pas de chromosome sexuel) environ 1,5 Giga-bases (1, 5 109 bases) début du séquençage en 2001; Voir publication : « The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome” Nature 2013 1,412,464,843 paires de bases (Zv9)  environ 26.206 gènes (codant pour des protéines) voir sites internet : NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish/index.html UCSC : http://genome.ucsc.edu/ Ensembl : http://www.ensembl.org (annotation « automatique ») Vega : http://vega.sanger.ac.uk/Danio_rerio/ (annotation vérifiée) Centre de distribution de clones (cDNA ou gDNA) (pour toutes les espèces) : ImaGenes : http://www.imagenes-bio.de/

3400 gènes dupliqués chez le zebrafish : paralogues Cause : duplication du génome durant l’évolution des téléostéens (environ 300 millions d’années) Exemple : le gène Pax6 Pax6a Pax6b 26 hpf 26 hpf Pax6a exprimé dans les yeux, SNC, cerveau postérieur (HB) Pax6b exprimé dans les yeux, SNC et le pancréas HB Vues latérales HB 48 hpf 48 hpf expression différente : partage de la fonction du gène ancestral  « subfonctionalisation »

: région non transcrite conservée Comparaison des séquences génomiques entre les gènes paralogues (et entre orthologues) Chr.25 Chr.7 : exon : région non transcrite conservée  Lignée transgénique P0Pax6:GFP

Fécondation et clivage Contact du spermatozoïde avec l’ovule au niveau du micropyle (pôle animal)  activation : entrée de Ca++ Fin de la meiose, détachement du chorion, mouvements cytoplasmiques (réserves nutritives restent au pôle végétal), mitoses synchrones (15 minutes). 15 minutes Après fécondation 30 minutes Après fécondation 30 minutes

Clivages symétriques et synchrones mais incomplets (méroblastiques) (Microscopie electronique) 45 minutes 1 heure (1hpf) 1:15 hpf (Microscopie optique : stéréomicroscope)

12ième division (3hpf) : Mid-Blastula-Transition Distinction de 3 types cellulaires : « deep cells » : cellules profondes  embryon « enveloping layer » : cellules « externes » (périderme) « Yolk Syncytial Layer » (YSL) : syncytium près de la zone marginale (dans le sac vitellin) fig11.5 p 329 Division des noyaux du syncytium  Nombreux noyaux dans le YSL.

 Mouvement d’épibolie (stades : % d’épibolie) Les cellules s’intercalent  Mouvement d’épibolie

La gastrulation du zebrafish A 50 % d’épibolie : mouvement d’involution  début de la gastrulation (5 hpf) La gastrulation du zebrafish (stade « germ ring ») Vue latérale Vue du pôle animal

Formation du bouclier embryonnaire (« shield ») Par les mouvements de convergence (  migration des cellules vers le côté dorsal) Fig 11.7 p331 « shield » Vue du pôle animal

l’épiblaste (ectoderme) L’hypoblaste (mésoderme et endoderme)  Formation de l’épiblaste (ectoderme) L’hypoblaste (mésoderme et endoderme) + mouvements de - Epibolie - Involution - Convergence-extension convergence vers le côté dorsal. extension de l’axe A-P

fig11.6 E p 330 Hypoblaste : ségrégation en - Endoderme (jaune) (sur le syncytium/sac vitelin) - Mésoderme (rouge)(en dessous de l’épiblaste) Tout le sac vitellin recouvert Fin de la gastrulation

Neurulation Somites notochorde

 Stade phylotypique Coupe transversale dans un embryon de zebrafish Notochorde Somite t. digestif Voir film similarité avec les amphibiens Mouvements d’épibolie, d’involution et de convergence-extension. NB: clivage méroblastique.

Identification de mutations récessives affectant le développement (génétique « directe ») Identification de mutants dans des gènes zygotiques + techniques d’embryologie expérimentale injection d’ARNm et de morpholinos antisens

… mais pas les facteurs maternels (F4) D.M. G.Z. Déterminant Maternel (ovocyte) Gènes zygotiques activés Identification des gènes régulateurs impliqués dans la formation des feuillets par sélection de mutants affectés --> identification du gène muté --> étude de son expression dans WT et mutants) 1996 : identification de plus de 1000 mutants affectant le développement du zebrafish. NB: Les gènes zygotiques peuvent être déctectés par la mutagenèse et criblage de mutant F3 … mais pas les facteurs maternels (F4)

Exemple : identification de mutants affecté au niveau de la notochorde.  Test de complémentation pour déterminer si les gènes mutés sont différents. (croisement entre mutants) Test d’épistasie : Gène A agit sur gène B (expression de B dans le mutant A , et inversément)

Axe Antéro-postérieur : 1) Facteurs déterminant les axes de l’embryon Axe Antéro-postérieur : Pole animal Pole végétal 45 m 2 h 5h Antérieur postérieur 9 h 11 h 18 h Axe A-P = Axe animal-végétal (identique au xénope)

Axe Dorso-ventral : Pas de « rotation corticale dans le zygote de zebrafish … Mais … Accumulation de β-caténine dans les noyaux uniquement du coté dorsal dans le syncytium et quelques blastomères Blastula de xénope Fig 11.10 p334 Blastula de zebrafish YSL (Immunohistochimie)e

Rôle de la β-caténine -surexpression de β-caténine du coté ventral (injection d’ARNm Au stade 64 cellules : Test de gain de fonction)  embryon à 2 axes (la β-caténine est suffisante pour déterminer le coté dorsal) Ichabod Phénotype identique par injection de morpholinos bloquant β-caténine 2 -Mutant « ichabod » (perte de fct): pas de côté dorsal = perte d’expression de β-caténine 2

Expérience démontrant la présence de déterminant maternel « dorsalisant »au pôle végétal de l’ovocyte  Déplacement de ce déterminant vers le côté dorsal lors des 3 premiers clivages. Phénotype Ichabod obtenu par incubation des œufs fécondés avec le nocodazole (Inh.de microtubules)

Comparaison poisson- amphibien pour l’axe Dorso-ventral ( YSL dorsal est l’équivalent du centre de Nieuwkoop) Expression de boz (facteur homéodomaine, rôle // siamois) WT Ichabod

Carte de destin chez le zebrafish : 2) Facteurs impliqués dans la formation des feuillets chez les poissons Carte de destin chez le zebrafish : Stade : 50% épibolie (pas avant ce stade) Vues latérales Disposition des 3 feuillets : axes Animal-végétal Similarité avec la carte de destin du xénope

Similarité des cartes de destin entre les blastula de xénope et de zebrafish Vue latérale Les mouvements cellulaires lors de la gastrulation sont similaires chez les poisson et les batraciens des mécanismes moléculaires similaires sont impliqués dans la formation des feuillets

Des facteurs maternel dans le pôle végétal déclenche la cascade régulatrice 2:30 hpf RNase Analyse à 5 hpf (vue du pôle animal) (vue du côté latéral)  Des ARNm du sac vitellin sont nécessaires pour l’induction de l’endoderme (gta5) et du mésoderme

Isolement de mutants avec un phénotype cyclope Localisation et identification des gènes mutés … cyclops : nodal-related 2 (nrd2) squint : nodal-related 1 (nrd1)

Expression de squint et cyclops 3 hpf 4hpf Vues latérales Cyclops 4hpf Vue du pôle animal Vue du côté dorsal Expression chevauchante dans la zone marginale  activité redondante ?

Double mutant Cyclop-Squint : Phénotype sauvage WT double mutant Cyclop-Squint Mutant MZ One-eyed-pinehead Double mutant Cyclop-Squint :  pas d’endoderme Pas de mésoderme (ectoderme) Signal Nodal mésoderme (Squint+cyclops) endoderme

le gène Oep est requis pour l’action des facteurs Nodal ARNm cyc + sqt (cas) Pas d’effet Embryon très affecté Masse de mésendoderme dorsal Pas d’effet Pas expression le gène Oep est requis pour l’action des facteurs Nodal Cyc + Sqt  Oep  endoderme et mésoderme

Voie de signalisation Nodal dans la formation du mésendoderme Page 20 solnica Bon (Mixer) Fau (Gata5) Cas (sox32) Mutants présentant une perte d’endoderme (et une « cardia bifida ») schmalspur FoxH1

Cyclop et Squint sont nécessaires pour activer 1) les facteurs transcriptionnels « endodermiques » Expression du gène Mixer (bon) (vue latérale) (stade fin blastula) ?  Nodal  Bon  Sox17  endoderme VegtT  (Xnr1) (Mixer) ( sox17) WT mutant Cyclops; Squint (Vue du pôle animal) Expression du gène Goosecoïd (homeobox) 2) les facteurs transcriptionnels «mésodermiques » Nodal (sqt/cyc)  goosecoïd (mésoderme dorsal) --> brachyury/Notail (mésoderme)

Mutant Notail chez le zebrafish (othologue Xbra) Mutants homozygotes 5 hpf 9 hpf Expression dans WT : « wild type » mutant oep ou cyc/sqt

Phénotype de Floating head (Zf-Not) WT Mutant Mutations

Action morphogène des signaux Nodal À forte concentration  ils activent des gènes « dorsaux » (goosecoïd, Not) À basse concentration  ils activent des gènes du mésoderme (No tail = brachyury) Injection d’ARNm squint dans des cellules du pôle animal

 Effet morphogène sur l’induction du mésoderme Expression des facteurs Nodal Par les cellules de la zone marginale et le « YSL » (gradient) Ectoderme Mesoderme Mésendoderme Endoderme  Effet morphogène sur l’induction du mésoderme - à faible Qté : activation de Notail (Brachyury) À grand Qté: activation de Goosecoïd , Not  mésoderme dorsal : notochorde et endoderme

Antagonisme entre le côté dorsal et ventral Et formation du gradient BMP Expression de Floating head (= Not) Goosecoïd Antagonistes des BMP : -Chordin (+ noggin et follistatin-L2) : Gradient d’activité BMP dans l’axe Dorso-Ventral (début gastrulation)

Chordin Le mutant « Chordino » : type sauvage (WT) Mutant Phenotype : « ventralisé » Mutation : Gène Chordin Expression : Mésoderme dorsal : - Notochorde atrophiée - Excès de cellules sanguines - parties antérieures tronquées - Système nerveux atrophié, … Stop

Rôle des gènes BMP (mutants « dorsalisé ») Snail house (snh, BMP4) Swirl (swr, BMP2b) WT -Absence de cellules sanguines -parties postérieures tronquées -cerveau hypertrophié, … swr Fig p77 Expression p82 Expression : Gradient D-V de BMP Chordin BMP

Résumé des facteurs impliqués dans la gastrulation chez le zebrafish Not (Goosecoïd) NoTail (T) Bon, Sox17 Signaux Nodal : (Cyclop,Squint) + β-caténine Antagonistes des BMP : Chordin  Gradient d’activité BMP

Cascade similaire chez les oiseaux et mammifères  Similarité avec le xénope. Facteurs maternels : Vg1, VegT Dishevelled Organisateur De Spemann Gradient Nodal Gradient BMP BMP Goosecoid Xnot Chordin Follistatin Noggin Centre de Nieuwkoop Cascade similaire chez les oiseaux et mammifères

L’axe Dorso-Ventral chez les invertébrés SOG (Short-gastrulation) est l’orthologue de chordin dpp (decapentaplegic) est un facteur TGFbeta Gradient BMP = tube neural NB : Axe D-V « inversé » chez les invertébré  hypothèse de Saint Hilaire (1822) Injection de SOG dans une blastula de xénope (du coté ventral)  formation de notochorde  Mécanisme conservé durant toute l’évolution des métazoaires

Gradient BMP