Aspects théoriques de la séparation chromatographique Anne Mortier

Chromatographie Place dans les laboratoires

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Chromatographie Historique  1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, sépare des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments sont entraînés avec de l'éther de pétrole  1940 : Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952  1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)  1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais  1979 : première séparation chirale par HPLC

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Qu’est-ce que la chromatographie? éluant Bande initiale avec les composés A et B PS tassée dans la colonne + PM disque poreux éluat BA

Chromatographie définition Méthode de séparation des constituants d’un mélange reposant sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles

Chromatographie Aspects généraux Phase stationnaire (PS) : immobilisée dans une colonne ou fixée sur un support plan(ccm) Phase mobile (PM) : se déplaçant au contact de la première Elution : processus par lequel un composé est entraîné par le mouvement de la phase mobile à travers la phase stationnaire

Chromatographie Aspects généraux Vitesse de la PM dans la colonne exprimée :  en débit,D : volume de solvant traversant la colonne par unité de temps (mL/min)  en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la colonne par unité de temps (cm/min)

Chromatographie Aspects généraux chromatogramme

Chromatographie Aspects généraux Chromatogramme : tracé des variations de composition de la phase éluée au cours du temps signal Temps (min)

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Chromatographie classification Selon le phénomène physique responsable des échanges entre PS et PM :  adsorption  partage  échange d’ions  exclusion  affinité Selon le nature physique de la phase mobile :  liquide  gaz Selon l’objectif visé :  chromatographie analytique  chromatographie préparative

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Chromatographie Appareillage colonne (PS) injecteur régulateur de pression débimètres détecteur signal temps Traitement du signal traitement du signal temps Entrée de l’échantillon Éluant liquide ou gazeux (PM) Sortie de l’éluat

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Chromatographie grandeurs de rétention Temps de rétention Volume de rétention Coefficient de distribution Facteur de rétention

Chromatographie grandeurs de rétention Temps de rétention: t R temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui est lié

Chromatographie grandeurs de rétention Temps de rétention réduit : t R ’ t R ’= t R – t M t M ou t 0 : temps mort : temps nécessaire pour qu’un composé non retenu traverse la colonne

Chromatographie grandeurs de rétention Volume de rétention V R ou volume d’élution : Volume de phase mobile nécessaire pour faire migrer un composé d’un bout à l’autre de la colonne V R = t R. D D : débit de la phase mobile (constant)

Chromatographie grandeurs de rétention Coefficient de distribution: K A rétention A PM A PS élution K A rapport entre la concentration du composé dans la phase stationnaire et la concentration du composé dans la phase mobile traduit l’importance relative des forces intermoléculaires qui existent entre le composé et les 2 phases

Chromatographie grandeurs de rétention Facteur de rétention k’ ou k (ou de capacité) : Rend compte de la faculté plus ou moins grande de la colonne à retenir un composé Indépendant du débit de la PM et des dimensions de la colonne k’ est accessible à partir du chromatogramme

Chromatographie grandeurs de rétention t R = t M + t R ’ Si composé non retenu par la PS : t R = t M = t PM : temps passé dans la PM  t R ’= t PS : temps passé dans la PS si m T = m PM + m PS k’ est indépendant de m T

Chromatographie grandeurs de rétention En chromatographie capillaire ( GC) : β est très élevé  t R réduits on peut prévoir le comportement des colonnes grâce à ce facteur β : pour un composé et une PS donnés, k’ diminue quand β augmente

Chromatographie grandeurs de rétention Facteur de rétention k’ et t R : t R = t M ( 1 + k’ ) t R = t M ( 1 + K / β) ⇒ permet de calculer le coefficient de distribution En pratique, k’ ne peut pas dépasser 10 k’ < 1: le composé sort trop tôt k’ ≈ 2-5 : correct

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Chromatographie Facteur de séparation ou de sélectivité α permet de préciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme : α est toujours supérieur à 1 α est l’aptitude d’un système chromatographique à séparer deux composés

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Modèle des plateaux déplacement du soluté dans la colonne en une suite d’étapes distinctes à chaque étape: A PM A PS colonne de chromatographie = série de compartiments distincts ou « plateaux théoriques » dans lesquels s’établit l’équilibre de répartition du soluté chromatographie = suite de temps d’équilibration suivis de glissements de la PM d’un plateau par rapport à la PS Instant I-1Instant I

Modèle des plateaux pics d’élution gaussien  Un soluté se déplaçant dans une colonne donne un signal d’allure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du détecteur   : écart-type  w 1/2 ou  = 2.35  : largeur à mi-hauteur  w ou w b : largeur à la base = 4 

Modèle des plateaux La colonne de longueur L est découpée en N petits disques fictifs ou « plateaux théoriques » de même hauteur H : N = nombre de plateaux théoriques  L en cm → H en cm

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

 l 2 = H. l H : coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et la longueur parcourue H : HEPT = hauteur équivalente à un plateau théorique l : longueur parcourue Efficacité d’une colonne Définition de H départ Profil de concentration colonne

Efficacité d’une colonne Définition de H  σ 2 en cm 2  l en cm → H en cm Valeurs de H:  0.1 à 1 mm en GC  ~ 10 μm en HPLC

Efficacité d’une colonne Conc.dans la colonne chromatogramme tRtR temps signal éluant L l σlσl détecteur

Efficacité d’une colonne évaluation quantitative N = mesure de l’efficacité d’une colonne si H ↓→ largeur de bande ↓ → séparation ↑ Car σ=W b /4 N est mesurable sur un chromatogramme Si N est constant, la largeur d’un pic chromatographique augmente quand le temps de rétention augmente

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Théorie de l’élargissement des bandes influence de la vitesse d’écoulement de la phase mobile la variance du pic (  2 ) est proportionnelle à H : quand H diminue, la largeur du pic diminue Équation de van Deemter : H = A + B/ u + C. u u = vitesse linéaire d’écoulement de la phase mobile A, B, C : constantes pour une colonne donnée et une PS donnée H min U optimal

Théorie de l’élargissement des bandes Equation de van Deemter A: diffusion turbulente ou diffusion de Eddy : terme dû aux multiples veines d’écoulement : A= λ.d p λ : facteur de remplissage de la colonne d p : diamètre des grains

Théorie de l’élargissement des bandes Equation de van Deemter Diffusion de Eddy temps

Théorie de l’élargissement des bandes Equation de van Deemter Colonne pleine : A ≠ 0 Colonne capillaire(G.C.) : A = 0 → Equation de Golay pour la GC en colonne capillaire : H C B H min Pas de dispersion des trajets H  Courbe de Golay u

Théorie de l’élargissement des bandes Equation de van Deemter B/u : diffusion longitudinale : diffusion du composé de la région concentrée d’une bande vers la région diluée γ : facteur d’obstruction ou de tortuosité D M : coefficient de diffusion : mesure la mobilité du composé dans la phase mobile plus faible dans les liquides que dans les gaz augmente avec la température diminue quand la viscosité du milieu augmente

C.u : cinétique de transfert de masse C. u = (C PS + C PM ).u Transfert de masse favorisé par : une faible épaisseur de phase stationnaire un petit diamètre de colonne une température plus élevée un coefficient de diffusion D M peu élevé (PM peu visqueuse) un faible débit d’éluant Théorie de l’élargissement des bandes Equation de van Deemter

En HPLC :  effet moins prononcé de B/U à très faible débit car D M beaucoup plus faible qu’en GC  La contribution du terme C.u sur H dépend de la vitesse de l’éluant de manière plus complexe u H

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Qualité d’une séparation Deux facteurs contribuent à une bonne séparation par chromatographie : la différence entre les temps de rétention la largeur des pics

Résolution La résolution est la qualité de séparation de deux pics voisins. Pour deux molécules A et B : W b = 4  temps signal tRtR W b (A) W b (B) t R (A)t R (B)

Résolution Normalement, des pics voisins ont des  pratiquement identiques. On trouve alors que :

Résolution R S = 1 si  t R = 4σ Une résolution de 1.5 est nécessaire pour une analyse quantitative (  t R = 6σ) signal temps signal 2σ2σ 3σ3σ 4σ4σ 6σ6σ Résolution = 1.5 Résolution = 0.50Résolution = 0.75 Résolution = 1 temps

Effet des facteurs de capacité et de sélectivité sur la résolution k’= facteur de capacité moyen de deux composés Quand α tend vers 1

Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps  augmenter N  modifier k’  augmenter α

Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps  augmenter N :  ↗ L : si L doublée, alors R augmente de √ 2 mais durée de séparation augmente  ↘ H : ↘ ∅ particules support ( ↘ terme A ) ↘ ∅ colonne ( ↘ terme C) ↘ T°(GC) ( ↘ terme B ) ↘ épaisseur du film liquide(GC) ( ↘ terme C) ↘ viscosité de la PM ( HPLC) ( ↘ terme C) optimiser u ( vitesse linéaire de PM)

Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ?  modifier k’:  k’ B optimum: 1-5  éviter k’ B >10 (durée d’élution ! )  modifier la T° (GC)  modifier la composition de la PM (HPLC)  diminuer l’épaisseur du film liquide et augmenter le diamètre interne de la colonne (modification de  en GC)  augmenter α si proche de 1 ( maintenir 1< k’< 10 )  modifier la T° de la colonne  modifier la composition de la PS  modifier la composition de la PM (HPLC)

Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Modification de k’ en cours d’élution : Par un gradient de composition ou programmation de solvant : augmentation graduelle ou continue de la puissance de l’éluant en cours d’élution (HPLC)  Modification de k’, α et de H  Amélioration de N et de R Par une programmation de température : augmentation graduelle ou continue de la température de la colonne en cours d’élution (GC)  Modification de k’, α et de H  Amélioration de N et de R

Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Programmation de température en GC Isotherme à 45° Isotherme à 130° Programmation de température de 30° à 180°

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Comment réduire la diffusion hors colonne?  Diffusion dans l’injecteur  Diffusion dans le détecteur σ 2 global = σ 2 colonne + σ 2 injecteur + σ 2 détecteur Variance du pic due à l’injection ou à la détection : Solutions : → minimiser les volumes morts (« tubing ») → détection « sur colonne », injection sur colonne (G.C.)

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Pics asymétriques? pic gaussien ↔ K = C S /C M indépendant de la concentration en composé dans la colonne pic asymétrique si K varie avec la concentration en soluté

Pics asymétriques ?  Fronting ou front diffus: la phase stationnaire est saturée  Tailing ou traînée : de petites concentrations en soluté sont davantage retenues que des plus grandes concentrations

Pics asymétriques L’asymétrie d’un pic est traduite par deux paramètres :  le facteur de traînée ou tailing factor (F t ou TF)

Pics asymétriques  le facteur d’asymétrie ou asymmetry factor (F a ou As) Valeurs normales: entre 1.0 et 1.5 pour une nouvelle colonne Valeurs un peu plus élevées dans des conditions réelles

Pics asymétriques ?  Fronting ou front diffus: F t <1 F a <1  Tailing ou traînée : F t >1 F a >1

Plan général  Historique  Définition – Aspects généraux  Classification des chromatographies  Appareillage  Grandeurs de rétention  Facteur de séparation  Modèle des plateaux  Efficacité d’une colonne  Théorie de l’élargissement des pics (Van Deemter)  Qualité d’une séparation - Résolution  Diffusion hors colonne  Pics asymétriques  Dégradation d’une colonne

Dégradation d’une colonne? Suivi de la performance d’une colonne :  Facteur de rétention d’un standard (k’)  Nombre de plateaux (N)  Asymétrie des pics

En conclusion.... Efficacité d’un chimiste analyste? En routine : « Do things in the right way »  rendement, productivité, économie  augmenter le potentiel de l’utilisateur et de l’instrument En recherche : « Do the right things »  résolution de problèmes analytiques complexes  réaction optimale et rapide à de nouvelles situations

Merci de votre attention! Références utiles: " Principes d'analyse instrumentale" Skoog, Holler, Nieman, De Boeck "Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, " Practical problem solving un HPLC", S. Kromidas, WILEY- VCH, 2005