Épithélium respiratoire et infection: interactions hôte - pathogène Jean-Damien Ricard INSERM U722 Ecologie et évolution des micro-organismes, UFR de Médecine Paris 7 Denis – Diderot Service de Réanimation Médicale Hôpital Louis Mourier Colombes jean-damien.ricard@lmr.aphp.fr

Interaction épithélium respiratoire hôtes pathogènes

Objectifs pédagogiques Énumérer brièvement les caractéristiques de l’immunité innée et de l’immunité adaptative Expliquer les conditions particulières du poumon dans sa lutte contre l’infection Lister les éléments de la défense contre les pathogènes Décrire la paroi des bactéries, les différences entre bactéries à Gram positif et négatif et leurs implications dans la relation hôte pathogène Énumérer les molécules sécrétées par l’épithélium respiratoire et leurs fonctions Décrire les mécanismes de reconnaissance des pathogènes Donner quelques exemples de facteurs de virulence des pathogènes

Immunité(s) Adaptative/acquise: - médiée par les lymphocytes T et B - spécificité - mémoire Innée: - (était considérée) non spécifique - liée à phagocytose des microorganismes et substances étrangères par macrophages et polynucléaires neutrophiles

Immunité innée Système ancien dans l’évolution: assurant aux organismes multicellulaires Des mécanismes de défenses immédiatement disponibles Contre une variété très large de pathogènes Sans besoin d’exposition préalables à ces pathogènes

Activation séquentielle de l’immunité innée et adaptative adaptive innate

Principales caractéristiques de la réponse innée Reconnaît des structures présentes dans de très nombreux microorganismes qui sont différentes du soi Active des mécanismes effecteurs qui vont détruire en quelques heures la plupart des microorganismes rencontrés au cours de la vie Active et oriente la réponse innée acquise (ou adaptative) qui, grâce à l’expansion clonale de lymphocytes, sera dirigée spécifiquement contre les microorganismes persistants

Les particularités du poumon (1) Frontière alvéolaire = la plus vulnérable de l’organisme Au contact de 15 000 litre d’air / jour contenant des centaines de microorganismes Surface de contact très importante (~ 150 m2) (60 fois la peau) Bien que la surface du tube digestif soit équivalente (~ 200 m2), celui est connecté à l’environnement en séries permettant des défenses séquentielles (amylase salivaire, acide gastrique, bile…) Les alvéoles sont exposées en parallèle à l’environnement

Les particularités du poumon (2) Objectif de la défense immunitaire du poumon = alvéole stérile (par opposition au maintien d’une flore normale), Le pool de leucocytes résidentes dans le poumon est relativement faible, Une barrière physique (telle que la peau) ou chimique (acide gastrique et bile du tube digestif) ne sont pas envisageable (fragilité de la membrane alvéolocapillaire) En conséquence: le risque de dissémination est grand du fait de la proximité entre les germes et le sang (deux couches cellulaires: épithélium et endothélium et faible interstitium)

Les acteurs de la relation hôte - pathogène

Les acteurs: épithélium respiratoire Barrière muqueuse Tapis mucociliaire Jonctions serrées Cascade de signalisation permettant: - sécrétions de mucines - peptides antibactériens (béta-défensines, lactoferrines) - cytokines et chémokines  recruter et activer les cellules immunitaires Récepteurs cellulaires spécifiques (Toll)

Première étape: franchir le tapis muco-ciliaire

Les acteurs: macrophage alvéolaire Monocyte phagocytaire résident du poumon Origine: lignée monocytaire Localisation : voies aériennes, espaces alvéolaires, interstitium, lit vasculaire, espaces pleuraux Fonctions sécrétoires Fonctions phagocytaires Fonctions bactéricides Fonctions régulatrices de l’immunité acquise

Les acteurs: macrophage alvéolaire Monocyte phagocytaire résident du poumon Origine: lignée monocytaire Localisation : voies aériennes, espaces alvéolaires, interstitium, lit vasculaire, espaces pleuraux Fonctions sécrétoires Fonctions phagocytaires Fonctions bactéricides Fonctions régulatrices de l’immunité acquise

Macrophages: fonctions sécrétoires Cytokines et chémokines: - IL-1 - TNF-alpha - IL-6 - IL-8 - MCP-1 - INF - Facteurs de croissance - …

Macrophages: fonctions sécrétoires Cytokines et chémokines: - IL-1: cellules cibles: - Lymphocyte T: costimulation de l’activation et prolifération - Lymphocyte B: croissance et différenciation - macrophage (autocrine): IL-1, IL-6, IL-8 - endothélium : molécules d’adhésion - TNF-alpha: - endothélium: activation et molécules d’adhésion - neutrophiles: activation, adhésion, et bactéricidie - macrophage (autocrine): stimulation sécrétion IL-1, IL-6, IL-8, augmente l’activité antimicrobienne

Macrophages: fonctions sécrétoires: implication du TNF-alpha

Macrophages: fonctions phagocytaires

Macrophages: régulation immunité acquise

Les acteurs: polynucléaire neutrophile Élément le plus important dans la défense antibactérienne Étape préalable: circulation, adhésion à l’endothélium, passage extravasculaire, migration, reconnaissance  Phagocytose Dégranulation Métabolisme oxydatif

Exemple du rôle capital du polynucléaire neutrophile CXC Chemokine Receptor CXCR2 Is Essential for Protective Innate Host Response in Murine Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. Tsai et al, Infection Immunity, 2000

Rôle capital du polynucléaire neutrophile: effet de la déplétion en PNN CXC Chemokine Receptor CXCR2 Is Essential for Protective Innate Host Response in Murine Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. Tsai et al, Infection Immunity, 2000

Rôle capital du polynucléaire neutrophile: effet de la neutralisation de CXCR2 CXC Chemokine Receptor CXCR2 Is Essential for Protective Innate Host Response in Murine Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. Tsai et al, Infection Immunity, 2000

Rôle capital du polynucléaire neutrophile: effet de la neutralisation de CXCR2 CXC Chemokine Receptor CXCR2 Is Essential for Protective Innate Host Response in Murine Pseudomonas aeruginosa Pneumonia. Tsai et al, Infection Immunity, 2000

Les acteurs: lymphocytes T

Les acteurs: cytokines et chémokines Sources Cibles Activité Mode d’action Hormone sécrétée principalement par un seul type de cellule Spécificité vis à vis d’1 cellule cible principale Essentiellement unique endocrine Cytokine produite par plsrs types cellulaires Nombreuses cellules Large spectre et redondance paracrine autocrine juxtacrine

Les acteurs: les récepteurs Toll

Les acteurs: les pathogènes

Les acteurs: les pathogènes: quelques rappels Structures des bactéries - bactéries à Gram positif - bactéries à Gram négatif - LPS - Peptigoglycane - acide teichoic - acide lipoteichoic

Parois des bactéries

Structure du LipoPolySaccharide (LPS)

Éléments de défense du poumon: sécrétions épithéliales

Molécules sécrétées par l’épithélium respiratoire Médiateurs de l’inflammation Substances chémo-attractantes Substances antimicrobiennes Cytokines Chemokines Leukotriènes calprotectin Béta-defensines Chémokines leukotriènes Béta-défensines Lysozyme lactoferrin SpA SpD

Buts de cette sécrétion Attirer (chemoattract) et activer les cellules immunitaires (immunité innée et immunité adaptative) Immobiliser et tuer les microorganismes Induire les processus de réparation cellulaire Initier et organiser la réponse immunitaire adaptative

Composition des sécrétions pulmonaires Dépend: - localisation anatomique - état local : présence ou non d’inflammation Principalement Lysozyme et Lactoferrin à la concentration d’un 0,1-1 mg/mL. Defensines: 100 ng/mL jusqu’à > 1mg/mL Béta-défensines: 1 µg/ml

Composition des sécrétions pulmonaires: lysozyme Enzyme de 14kDa dirigée contre le pont ß 1-4 glycosydique entre les résidus N-acetylglucosamine et N-acetylmuramic du peptidoglycane Très actif contre les bactéries à Gram positif, Inactif contre les bactéries à Gram négatif, sauf après potentialisation par des cofacteurs (lactoferrine, acide ascorbique, complément) qui désorganisent la membrane externe ce qui permet l’accès du lysozyme au peptidoglycane. Fait partie des granules phagocytiques et sécrétoires des neutrophiles, Également produit par les macrophages et les cellules épithéliales

Sécrétion de l’épithélium respiratoire: importance du lysozyme Mouse Lysozyme M is important in pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae infection. Markart et al, AJRCCM 2004

Mouse Lysozyme M is important in pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae infection. Markart et al, AJRCCM 2004

Sécrétion de l’épithélium respiratoire: importance du lysozyme Mouse Lysozyme M is important in pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae infection. Markart et al, AJRCCM 2004

Composition des sécrétions pulmonaires: lactoferrine protéine de 80kDa proche de la transferrine Fixe le fer indispensable pour la respiration microbienne Très abondante dans les granules des neutrophiles et dans la sécrétion épithéliale Inhibe la croissance bactérienne en séquestrant le fer, A bactericidal effect for human lactoferrin. Science. 1977 Arnold RR et al.

Effet de différentes concentrations de lactoferrine A component of innate imunity prevents bacterial biofilm development. Singh et al, Nature, 2002

Lactoferrine - Lactoferrine + 4 h 24 h

Lactoferrine - Lactoferrine + 3 jrs 7 jrs

Fe-saturated lactoferrin Effect of iron chelation by deferoxamine on P. aeruginosa twitching motility. No lactoferrin Fe-saturated lactoferrin Fe-unsaturated lactoferrin

Vérification de l’absence de béta défensin 1 chez les souris knock-out. Diminution de la clearance bactérienne (ici H. influenzae)

Réaction inflammatoire intacte

Western blot 1: 20 ng of synthetic LL-37 peptide 2: serum control vector coding for b-galactosidase 3, 4: serum vector coding for LL-37 /hCAP-18 (crude, RP-HPLC purified) 5: 20 ng of synthetic LL-37 peptide 6: BALF vector coding for b-galactosidase (crude); 7, 8: BALF vector coding for LL-37/hCAP-18

JCI 1999

Composition des sécrétions pulmonaires: SpA et SpD

SpA et infection à Streptocoque B Surfactant Protein-A Binds Group B Streptococcus Enhancing Phagocytosis and Clearance from Lungs of Surfactant Protein-A-Deficient Mice. LeVine et al, AJRCMB, 1999

Déficit en SpA et SpD et lutte contre l’infection bactérienne Streptocoque B Haemophilus Distinct Effects of Surfactant Protein A or D Deficiency During Bacterial Infection on the Lung. LeVine et al, J Immunol 2000

Diminution de la phagocytose Distinct Effects of Surfactant Protein A or D Deficiency During Bacterial Infection on the Lung. LeVine et al, J Immunol 2000

Déficit en SpD et infection à virus Inflenza A Surfactant Protein D Enhances Clearance of Influenza A Virus from the Lung In Vivo. LeVine et al, J Immunol, 2001

La famille des récepteurs Toll Protéines transmembranaires de type 1. Caractérisées par: - extrémité NH2-terminale extracellulaire avec un domaine riche en leucine répétitif (leucine-rich repeat domain LRR) - extrémité COOH-terminale intracellulaire comportant une région possédant de nombreuses homologies avec le récepteur à l’IL-1 et donc appelée TIR = Toll/IL-1 homology domain

La famille des récepteurs Toll Protéines transmembranaires de type 1. Caractérisées par: - extrémité NH2-terminale extracellulaire avec un domaine riche en leucine répétitif (leucine-rich repeat domain LRR) - extrémité COOH-terminale intracellulaire comportant une région possédant de nombreuses homologies avec le récepteur à l’IL-1 et donc appelée TIR = Toll/IL-1R homology domain

% survie des drosophiles après inoculation

Activation de NFKappaB par des cellules transfectées par la chimère CD4/hToll Contrôle négatif: vecteur vide Contrôle positif: PMA+PHA

Réponse cellulaire au LPS: Toll le lien manquant Plusieurs récepteurs au LPS déjà connus: - LBP = LPS binding protein - CD 14 (forme membranaire et soluble mais absence de domaine cytoplasmique)

Reconnaissance bactérienne Gram+ Gram- ADNb ADNb flagelline LPS lipopeptides lipopeptides peptidoglycan LTA Cellule immunitaire

Reconnaissance bactérienne : récepteurs Toll ADNb ADNb flagelline LPS lipopeptides lipopeptides peptidoglycan LTA CD14 TLR2 TLR4 TLR9 TLR5 NODs

Reconnaissance bactérienne : récepteurs Toll LTA lipopeptides LPS flagelline TLR2 TLR4 TLR9 peptidoglycan TLR5 ADNb NODs

Expression des TLR Ubiquitaire: la plupart des tissus exprime au moins un TLR (Zarember KA, Godowski PJ. 2002. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation o f Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J. Immunol. 168:554–61) Cellules en première ligne de la défense anti-infectieuse: polynucléaires, macrophages, Lymphocytes B et T, Cellules dendritiques, Cellules en contact avec le milieu extérieur: épithélium respiratoire (macrophages alvéolaires et Pneumocytes II), épithélium intestinal, épiderme, cornée Endothélium, cardiomyocytes, adipocytes

Régulation des TLR L’expression des TLR est modulée en réponse à des stimulations très variées: invasion microbiennes, composants de bactérie, cytokines, Elle semble différente en fonction des organes concernés:

Reconnaissance du germe: conséquence sur la survie J Immunol ,2000, 165: 5392–5396.

Reconnaissance du germe: conséquence sur le contrôle de l’infection

Importance de la transduction du signal: rôle de MyD88 J Immunol ,2000, 165: 5392–5396.

Exemple d’implication chez l’homme

Objectifs pédagogiques Énumérer brièvement les caractéristiques de l’immunité innée et de l’immunité adaptative Expliquer les conditions particulières du poumon dans sa lutte contre l’infection Lister les éléments de la défense contre les pathogènes Décrire la paroi des bactéries, les différences entre bactéries à Gram positif et négatif et leurs implications dans la relation hôte pathogène Énumérer les molécules sécrétées par l’épithélium respiratoire et leurs fonctions Décrire les mécanismes de reconnaissance des pathogènes Donner quelques exemples de facteurs de virulence des pathogènes