Institut des cellules Souches pour le Traitement et l'Etude des maladies Monogéniques Comment réparer le cerveaux et ses annexes avec les cellules souches pluripotentes humaines

L’équipe De l’équipe s’occupant des Rétinopathies Christelle MONVILLE De l’équipe s’occupant des Lésion Neurovasculaire Jérôme POLENTES Brigitte ONTENIENTE Marion BRENOT Sébastien DUPRAT

Sommaire 1_ Culture 1 2_ Différenciation 2 3_ Les applications 3 Pourquoi utiliser des cellules souches ? Cellules hES et IPS Mefs hESC, hiPS 1 2_ Différenciation Cellules RPE ( Retinal pigmented epithelium)  Cellules souches neurales ( NSC ) → Immunohistochimie 2 3_ Les applications Les greffes La thérapie cellulaire 3

Pourquoi les cellules souches pluripotentes humaines ? I. Culture des cellules pluripotentes Pourquoi les cellules souches pluripotentes humaines ? Auto-renouvellement illimité Pluripotence i.e potentiel de différenciation maximum Mais quel sont les intérêts d’utiliser les cellules souches pluripotentes humaines ? Elles ont la capacité de s’autorenouveller de façon illimitée c’est-à-dire qu’elles se divisent pour donner 2 cellules identiques de façon quasi illimitée en culture. C’est très important car cela permet d’avoir une quantité importante de cellules. Pour comparer, les cellules souches adultes ont une capacité d’autorenouvellement plus limitée (sont donc moins intéressantes pour nous). Elles sont pluripotentes, c’est-à-dire qu’en théorie, à partir d’une cellule ES, on peut obtenir tous les tissus de l’organisme selon les conditions de culture. A la différence des cellules souches adultes qui sont déjà spécialisées vers un type cellulaire. Cependant, en pratique, on ne connait pas toutes les façons d’y arriver. Pour simplifier ça, c’est comme une recette de cuisine ; il faut ajouter les bons éléments au bon moment. On connaît quelques recettes pour le moment telles que celle pour obtenir les cellules neuronales par exemple. 4

Quels types de cellules souches pluripotentes humaines ? I. Culture des cellules pluripotentes Quels types de cellules souches pluripotentes humaines ? 5 Fécondation in vitro Diagnostic Génétique (D.P.I*) Biopsie, fibroblastes Embryon surnuméraire Reprogrammation Blastocyste Il existe 2 types de cellules souches pluripotentes humaines : les cellules souches embryonnaires humaines (ou hES) et les cellules souches pluripotentes induites (ou IPS). Mais comment fait-on pour les obtenir ? Cellules souches embryonnaires humaines ou hES : Après une fécondation in vitro, si les embryons surnuméraires sains non utilisés ne font plus l’objet d’un projet parental, les parents ont la possibilité de les donner à la science. Chez certaines familles à risque ayant déjà un enfant malade, un diagnostic préimplantatoire (ou DPI) est possible. Au stade 8 cellules, 2 sont prélevées. Les 6 restantes sont suffisantes pour donner un embryon. Si l’embryon est porteur de la mutation, il peut être donné à la science après accord parental. Mais seul un nombre limité de mutations peut être diagnostiqué. A partir des embryons sains ou mutants récupérés, on prélève les cellules de la masse interne (~30 cellules) au stade blastocyste. Les cellules sont mises en culture sur des cellules nourricières. Et on obtient des cellules hES. Cellules souches pluripotentes induites ou IPS : Les IPS, quant à elles, sont des cellules provenant de biopsie de patients adultes (stade terminal) et reprogrammées à un stade de cellules embryonnaires grâce à des virus . On obtient des cellules souches ayant les mêmes caractéristiques que les cellules ES sans être passé par un embryon. Inconvénient : Le problème majeur est l’utilisation de virus. Nous n’avons pas assez de recul sur les virus pour savoir s’ils sont bien éteints. Donc pour la thérapie, c’est encore trop précoce. Avantage : Mais elles sont meilleures que les hES pour la compréhension de la mutation. Ca ouvre à une plus large gamme de mutations que pour les autres. Cellules souches pluripotentes induites (iPS) Cellules souches embryonnaires humaines (hES) 5

Les mef (mouse embryonic fibroblast) I. Culture des cellules pluripotentes Les mef (mouse embryonic fibroblast) Cellules nourricières provenant de la souris Culture de mefs

Epithélium rétinien dérivé des cellules pluripotentes II. Différenciation Epithélium rétinien dérivé des cellules pluripotentes Cellules embryonnaires humaines Production in vitro de RPE humains Injection In vitro X40

II. Différenciation RPE confluentes RPE décollées comptage Trypsine 5min, 37°C Remise en culture des RPE (500000c/cm2) Immunocytochimie 10j de culture Bleu= noyaux Vert= membrane cellulaire

Cellules souches neurales dérivées des cellules pluripotentes II. Différenciation Cellules souches neurales dérivées des cellules pluripotentes Ki67 Nest ine DAPI TUj1 GFAPDAPI Ki : division cellulaire Nestine : progéniteur neural (neurones et des astrocytes) Nestine (Nest) est un marqueur qui permet de repérer les cellules non différenciées sur les cultures de NSC. A l’inverse, MAP2 permet de localiser les cellules qui se sont différenciées en neurones, de même que TUJ1. Toutefois TUJ1 permet de repérer les neurones en devenir de façon plus précoce que MAP2 (cas que les cellules qui se différencient en neurones seront Tuj1 avant d’être MAP2 positives). GFAP est un marqueur d’astrocytes, un type de cellules qui ne sont pas des neurones, mais vers lequel les NSC peuvent éventuellement se diriger lors de leur différenciation, bien que ce ne soit pas le but. Tuj1: Neurones et GFAP: astrocytes Cellule souche neurale

Principe de l'immunofluorescence L'immunofluorescence sert a vérifier le type de cellule présente dans une culture ou une greffe.Il faut préparer des anticorps primaires qui vont venir se fixer sur les cellules spécifiques aux anticorps dans la culture ou sur la coupe de cerveau ayant subi une greffe.L'anticorps secondaire,contrairement au primaire, est fluorescent.Il va se fixer au anticorps primaires. Il faut ensuite rincer la coupe de cerveau ou la culture dans du PBS ( phosphate Buffer Salt ) pour enlever le surplus d'anticorps.Il ne reste plus qu'à observer au microscope. Anticorps Primaires Cellule Anticorps secondaires

Les Greffes III. Applications Coupes de cerveau de rat ayant subi une greffe Colorées au Cresyl Violet Début de la greffe Greffe Fin de la greffe Avant du cerveau Arrière du cerveau

Remerciements Mme Cassini Mme Bonafin Mme Rivière Mr Deroin Mme Henez