Échecs d’implantation. Des gamètes à l’avortement précoce. Patrice CLEMENT LBC CLEMENT Département de Génétique et Reproduction. Blanc Mesnil Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Laboratoire CLEMENT Département Génétique et Reproduction

AMP avec grossesse évolutive Qualité utérine Qualité embryonnaire : -cytoplasmique -génétique -épigénétique Qualité des gamètes Immaturité cytoplasmique Arrêt ou retard de développement embryonnaire précoce Anomalies chromosomiques FCS Polymalformation Absence de grossesse Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Développement embryonnaire (Ménézo et col, RBM Online, 2006) Facteurs paternels Avant activation du génome embryonnaire (J3) Rôle du centrosome : dans les premières divisions. Rôle du packaging de la chromatine: formation des PN A partir de l’activation du génome embryonnaire -Rôle de la qualité du génome : fragmentation ADN et aneuploïdie Facteurs maternels Avant activation du génome embryonnaire (J3) -Pool des métabolites ovocytaires : E réparation ADN, E du stress oxydatif, E de décondensation du noyau Spz, ARNm… Age diminue la qualité du pool de métabolites A partir de l’activation du génome embryonnaire (J3) -Rôle de la qualité du génome: gènes, aneuploïdie (augmente avec l’âge) Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Organisation du Génome embryonnaire (Ménézo et col, RBM Online, 2006) Développement normal nécessite une complémentarité entre le génome paternel et le génome maternel : phénomène lié à l’empreinte. Désorganisation du phénomène d’empreinte a un effet délétère sur le développement embryonnaire précoce et post implantatoire. Phénomène d’empreinte : lié au processus de méthylation de l’ADN sur certains gènes. Rôle des cultures in vitro dans ce contexte ? Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

En pratique diagnostic biologique devant échecs répétés d’implantation Étude de l’embryon : Loi de bioéthique. Aneuploïdie (Plateau et col, 2005; Munné et col, 2003; Menesha et col, 2005) Femme > 38 ans : dans 25% des cas, 100% des embryons sont aneuploïdes Puce d’expression montrent des différences pouvant expliquer des anomalies de développement (Wells et col, 2005) Étude des ovocytes : - Uniquement possible sur ovocytes non fécondés. Étude des spermatozoïdes : qualité du génome Fragmentation de l’ADN. Aneuploïdie : utilisation de la FISH. Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Indication de la FISH sur spermatozoïdes. Échecs de développement embryonnaire précoce en AMP (surtout en cas d’OAT) Homme à caryotype normal Échecs répétés d’implantation Martin et col, Cytogenet cell, 1990 Rives et col, Hum Genet, 1999 Calogero et col, Hum Reprod, 2003 Gianaroli et col, Hum Reprod, 2005 FCS à répétition Analyse de la ségrégation des chromosomes dans les Spz Homme avec anomalie de caryotype Martin et col, 1995 Honda et col, 2000 Shi et col, Reprod, 2001… Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction The results of Preimplantation Genetic Diagnosis in embryos developed from the injection of spermatozoa in cases with macrocephal sperm sample. Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Laboratoire CLEMENT Département Génétique et Reproduction

Évaluation de la non disjonction chromosomique X et Y par l’utilisation de FISH multi couleur Abnormal XY Normal Y Normal X 18 Y Three color FISH image in a macrocephal sperm sample presenting X and Y non-disjunction in the left side while the other two on the right were haploid. Prob 18 was used as the internal control. X 18 Y X 18 Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Laboratoire CLEMENT Département Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction RESULTAT DE LA FISH SUR SPERMATOZOIDES Sondes utilisées : 5 sondes 13, 18, 21, X et Y Kit Aneuvision Abbott. Valeurs usuelles : 0,4 à O,8% de disomie par chromosome étudié. Augmentation significative à partir de 1% (1,5% pour certaines études) Exploration seulement d’une partie des chromosomes. Augmentation de la disomie en faveur d’une mal ségrégation des chromosomes au niveau de la méiose pendant la spermatogenèse. Cette disomie peut expliquer un échec de développement embryonnaire plus ou moins précoce. Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Aneuploïdie des Spz et résultats d’ICSI (Burrello N et al; Hum Reprod, Vol 18, 2003) FISH sur spermatozoïdes (5 sondes) : patients ICSI (oligo) Groupe A (12 patients): taux d’aneuploïdie identique à population témoin Groupe B (36 patients): augmentation du taux d’aneuploïdie (>1%) Groupe A Groupe B Taux de fécondation 93% 85% NS Taux de clivage 100% 98% Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Groupe A Groupe B Taux d’implantation 34% 13% P<0,001 Taux de grossesses 75% Taux de FCS précoces 11,1% 38,9% Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Chromosome analysis of epididymal and testicular sperm in azoospermic patients undergoing ICSI Gianpiero D. Palermo, Liliana T. Colombero, June J. Hariprashad, Peter N. Schlegel and Zev Rosenwaks Human Reprod, 2004 Nullisomie Disomie des autosomes (18, 21) gonosomes Diploïdie Sp testiculaire 3,7% 2% 4,3% 1,4% Sp épididymaire 0,43% 0,51% 0,61% 0,24% Sp éjaculé 0,27% 0,45% 0,33% p <0,0001 Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Que faire devant un patient avec une augmentation de l’aneuploïdie des Spz Contrôle sur nouveau prélèvement Svt identique DPI Impossible en France pour cette indication Refaire tentative AMP avec: IMSI Culture prolongée Don de sperme Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Homme avec anomalie de structure du caryotype Translocation réciproque Robertsonienne 5 à 20% de Spz déséquilibrés Translocation réciproque 20 à 80% de Spz déséquilibrés Inversion % de Spz déséquilibrés fonction des points de cassure Analyse par FISH des spermatozoïdes Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction Probe combination for rob(13;14)(q11;q11) 13 14 Normal LSI 13 (SG) Tel 14q (SO) Balanced Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction 45,XY, rob(13;14)(q11;q11) LSI 13 (SG) Tel 14q (SO) Normal or balanced Nullisomy 14 Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction

Conclusion FISH sur spermatozoïdes Exploration de la qualité du génome paternel (exploration globale et partielle). Pas un examen de première intention. A faire devant échecs d’implantation, FCS répétées, surtout chez patients avec oligozoospermie; et sur patients avec anomalie de caryotype. Laboratoire CLEMENT. Génétique et Reproduction