LES CELLULES DENDRITIQUES Franck HALARY UMR CNRS 5164 (Bordeaux) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES Généralités sur les Cellules Dendritiques : Historique « Milestones » Origines/Phénotypes Rôles/Fonctions immunologiques Miscellanées Cellules Dendritiques et Thérapie humaine : Interactions CD/cytomegalovirus humain Master 2 Immunologie - 03/10/2007

HISTORIQUE « Milestones » DES DC 1796 : 1er essai de vaccination anti-variolique par Jenner. 1868 : 1ère observation par Langerhans dans la peau humaine. 1973 : Identification chez la souris. Steinman RM et al. J Exp Med. 1973;137:1142-62. 1992 : Cultures in vitro. Caux C et al. Nature 1992;360: 258-261 (CSH CD34+ humaines). Inaba, K.et al. J. Exp. Med.1992; 176: 1693-1702 (précurseurs moelle murine). Sallusto F et al. J. Exp. Med.1994; 179(4):1109-18 (monocytes sanguins humains). 1998 : Utilisation en essais thérapeutiques. Nestle, F.O. et al. Nature Med.1998;4:328-332 Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES Généralités sur les Cellules Dendritiques : Historique « Milestones » Origines/Phénotypes Rôles/Fonctions immunologiques Miscellanées Cellules Dendritiques et Thérapie humaine : Interactions CD/cytomegalovirus humain Master 2 Immunologie - 03/10/2007

MORPHOLOGIE ET ULTRA STRUCTURE DES DC Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ORIGINES Less than 0,1% of all leukocytes Master 2 Immunologie - 03/10/2007

D ’après Banchereau & Steinman, Nature 1998 CYCLE DES CELLULES DENDRITIQUES D ’après Banchereau & Steinman, Nature 1998 Toxines, allergènes, pathogènes (bactéries, virus, etc.) Lymphocytes spécifiques activés Elimination du pathogène Vaisseau sanguin (HEV) Épithélium MIP3a DC Immature CCR6 Organe lymphoïde secondaire (i.e. ganglion lymphatique, CCL19/MIP3b) DC Mature CCR7 CCL21/6C-kine preDC (CD14+, CD11c+, CD11c-) Moëlle osseuse Master 2 Immunologie - 03/10/2007

+ + + - - + - + + - - + - + + + - - - + + + - - + - - + - - PHENOTYPES CD1a - + - CD2 + + - CD11c - + - CD14 + + + HLA-DR - - - CD19, CD56, CD3 (lin) CD80, CD86, + + + CD40 - - + CD123 - + - DC-SIGN + - - Langerin Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Some peripheral DC markers Iso DAPI CD1a DAPI Lang DAPI LP E CD44 DAPI DC-SIGN DAPI Master 2 Immunologie - 03/10/2007

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La rencontre cellule dendritique/pathogène : activation/maturation inflammation Agent pathogène TLR muqueuse C-Lectine Capture Cellule dendritique Les cellules dendritiques, ou DC, jouent un rôle central dans l ’initiation et l ’entretien de la réponse immunitaire anti-infectieuse. Elles résident dans les tissus périphériques tels que les muqueuses et sont capables de détecter très précocement l ’intrusion d ’agents pathogènes dans l ’organisme grâce à une famille de récepteurs appeléeTLR pour « Toll like Receptors », avant de les capturer pour les digérer et en présenter les antigènes aux cellules effectrices de la réponse immunitaire adaptative et ce grâce à une autre famille de récepteurs, les C-lectines. Il y a 6 ans maintenant, plusieurs publications ont montré que les DC étaient en mesure de capturer et d ’internaliser le VIH grâce à une C-lectine appelée DC-SIGN. Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ACTIVATION/MATURATION DES DC Toxines, allergènes, pathogènes (bactéries, virus, etc.) Vaisseau sanguin (HEV) épithélium DC immature Elimination du pathogène CSH preDC DC mature Lymphocytes spécifiques activés Moëlle osseuse Master 2 Immunologie - 03/10/2007 Organe lymphoïde secondaire (i.e. ganglion lymphatique)

STIMULI D ’ACTIVATION/MATURATION DES DC Stimulus Details Microbial products Via Toll-like, NOD, RIG-I, Mda5 receptors Lymphocytes (natural killer, NKT, gammadelta T, alphabeta T) and neutrophils Via CD40, lymphotoxin alphabeta receptors Cytokines TNF, interferons, TSLP and IL-10 Endogenous ligands Uric acid, histamine, heat shock proteins, high mobility group box protein 1, defensins, ATP Immune complexes Via activating and inhibitory FcR From the following article: Taking dendritic cells into medicine Ralph M. Steinman & Jacques Banchereau Nature 449, 419-426(27 September 2007) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ACTIVATION/MATURATION DES DC Master 2 Immunologie - 03/10/2007

VOIE DES TLR (Toll-Like Receptors) acide lipoteichoique lipopeptides (Pam3CSK4) peptidoglycan ? Zymozan, CMV ? Flagelline Viral ssRNA Imiquimod CpG déméthylé ? dsRNA poly I:C LPS Bactéries uropathogènes Activation de NFkB Cytokines pro-inflammatoires : TNFa, IL1b, IL6, IL12, etc. Master 2 Immunologie - 03/10/2007

PHENOTYPES DC/ Toll-like Receptor MONO mDC pDC TLR1 ++ +/- TLR2 ++ - TLR3 ++ - TLR4 - + TLR5 +/- - + TLR6 +/- TLR7 - + TLR8 - + +/- TLR9 - ++ TLR10 +/ - Kadowaki et al., J. Exp. Med., 2001 Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Récepteurs lectiniques de type C (CLR) B: B cells, DC: dendritic cells, LC: Langerhans cells, Mo: monocytes, M: macrophages, PMN: polymorphonuclear cells, LDNF: GalNAc1-4(Fuc1-3)GlcNAc, ManLAM: mannosylated lipoarabinomannan, tPA: tissue plasminogen activator, ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif *: mannose receptor, **: intermediately-differentiated M Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Activation des cellules T naïves Récepteurs lectiniques de type C des DC Myéloïdes Activation des cellules T naïves Capture des antigènes Adhésion/migration Récepteurs solubles aux antigènes Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES Cellule professionnelle présentatrice de l ’antigène (LT naïfs). 10-100 X de complexes pCMH [autres APC : lymphocyte B, monocyte et macrophage]. DC mature (« interdigitating ») cellule dendritique lymphocyte T naïf ACTIVATION CD2 LFA-3 pCMH LFA-1 actif ICAM-1 TCR/CD3 CD4/CD8 CD80/86 (B7.1/2) CD28 Organe lymphoïde secondaire Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES Capacité de présentation croisée d ’antigène. Voie classe I (endogène) Voie classe II (exogène) Présentation croisée (« cross-presentation » or « cross-priming ») From the following article: Recent advances in antigen processing and presentation Peter E Jensen Nature Immunology 8, 1041 - 1048 (2007) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES Recrutement in situ des autres acteurs des réponses immunitaires innées et adaptatives. Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES Induction de la Tolérance immunologique. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans (Blood 2002 Jul 1;100(1):174-7). Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells (J Exp Med 2002 Mar 18;195(6):695-704). Master 2 Immunologie - 03/10/2007

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GENERATION DE DC MYELOIDES HUMAINES in vitro CSH CD34+ (tri, cordon ou sang mobilisé) Monocytes (tri ou adhérence) imDC intersticielles Langerhans imDC intersticielles Master 2 Immunologie - 03/10/2007

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CELLULES DENDRITIQUES ET THERAPIES From the following article: Taking dendritic cells into medicine Ralph M. Steinman & Jacques Banchereau Nature 449, 419-426(27 September 2007) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DENDRITIC CELLS IN CLINICAL USE : Cancer immunotherapy Goal : Induce a specific immune response directed against tumoral antigens. Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LOADING ANTIGENS ON DENDRITIC CELLS Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Seul traitement : la chirurgie LE MELANOME 1932 : 1/1500 2000 : 1/75 Enfance et UV +++ Survie à 5 ans : 70 à 85% Seul traitement : la chirurgie Pourtant le mélanome est immunogène Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Fragments de tumeurs Présentation croisée d’antigènes contenus dans des corps apoptotiques (Albert, Nature, 1998) Source d’antigènes de rejet tumoral ? Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Les DC internalisent les fragments de cellules tumorales... Master 2 Immunologie - 03/10/2007

... puis induisent in vitro la prolifération de cellules T autologues... Cellules T CD4+ Cellules T CD8+ 2000 4000 6000 8000 500 1000 5000 DC DC+Mel 2500 5000 7500 10000 500 1000 DC DC+Mel Incorporation de Thymidine Nombre de DC par puit Master 2 Immunologie - 03/10/2007

... ainsi qu’une réponse CTL primaire Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Cette réponse est dirigée contre des TAA CTL assay : - Cellules T éduquées vs CTRL - Cibles = cellules T2 pulsées avec peptides relevants / irrelevants - T « éduqués » + peptides mélanome Mesure de la production d’IFNg par ELISPOT : restimulation (1 nuit) des cellules T par DC + peptides relevants / irrelevants - T « éduqués » - peptides irrelevants - T CTRL - peptides mélanomes Master 2 Immunologie - 03/10/2007

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ROLE OF DC IN TRANSPLANT REJECTION PRESENTATION Key role of DCs in transplant rejection via the presentation of alloantigens or Tolerance (immature « Passenger Leukocytes ») MATURATION Act of Transplantation by itself induces maturation signals. Role of recurrent infections. Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLE OF DC IN TRANSPLANT REJECTION: Indirect and direct allorecognition. From the following article: The complementary roles of deletion and regulation in transplantation tolerance Robert I. Lechler, Oliver A. Garden and Laurence A. Turka Nature Reviews Immunology 3, 147-158 (February 2003) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

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Introduction : le cytomégalovirus humain - Herpesvirus b (HHV-5). - Prévalence : 40 - 100% (réservoir 100% humain). - Primo-infection puis ré-activations/ré-infections. - Immuno-suppresseur (idem VIH et virus de la rougeole). Glycoprotéines d ’enveloppe (gB, gH, etc.) Enveloppe virale Le CMV humain est un virus enveloppé ubiquitaire dans la population. A l ’instar du VIH ou du virus de la rougeole, le CMV est considéré comme un virus très immuno-suppresseur, c ’est-à-dire capable de détourner certains mécanismes de défense immunitaire voire d ’utiliser le système pour son propre bénéfice. Il est capable d ’infecter de nombreux types cellulaires in vivo et in vitro dont les cellules dendritiques chez lesquelles il induit une paralysie fonctionnelle. Tégument (pp65) Capside ADN (double brin) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Les voies d’entrées Modes de transmission majeurs Infection périnatale/petite enfance : muqueuse oropharyngée (lait maternel, salive). Adultes : muqueuse génitale (sécrétions séminales). Représentation schématique de l’organisation cellulaire au niveau des muqueuses Deux voies d’entrées majeures : petite enfance , muq oropharyngée  salive, lait maternel D’où le fait de s’intéresser à ces muqueuses qui sont des épith Fibroblastes LC : Cellules de Langerhans DDC : Cellules dendritiques dermales Coupe histologique d’une muqueuse oropharyngée Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Is DC-SIGN able to bind CMV and to promote infection ? Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN : histoire et principales caractéristiques DC-SIGN (ou CD209) : Lectine de type C : 45 kDa. Dépendante des ions Ca2+ . Ligands ou pathogènes reconnus actuellement : HIV (gp120), CMV (gB), HCV, Dengue Virus, Ebola, M. tuberculosis., Leishmania, H. pylorii, Schistosoma mansoni and ICAM-2/3. Profils d ’expression : DC et macrophages (in vivo/in vitro). Geijtenbeek et al., Cell, 2000 Observation : Infection par le HIV (gp120) indépendante de CD4 sur certaines lignées cellulaires. 1992 : clonage d ’un ADNc codant pour une lectine capable de lier le mannose et la gp120 ( du CD4), à partir d ’une banque de placenta (Curtis et al., PNAS). 2000 : identification d ’une lectine de type C capable de fixer ICAM-3 ( de LFA-1 et /ou l ’aD-b2 integrin), exprimée sur les DC. L ’analyse de la séquence montre une homologie complète avec l ’ADNc cloné par Curtis et al.  DC-SIGN (DC-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin). Domaine de liaison aux carbohydrates (CRD) Répétitions de domaines Ig identiques Domaine cytoplasmique Motif YXXL Motif LL Master 2 Immunologie - 03/10/2007

As a pathogen binding receptor In trafficking and T cell priming DC-SIGN... As a pathogen binding receptor In trafficking and T cell priming 1. tethering ICAM-2 DC-SIGN LFA-1 inactif DC 2. arrest ICAM-1 LFA-1 actif DC LT gp120 HIV infection en trans endothelium Dendritic cell infection en cis LFA-3 pCMH DC-SIGN CD4 CCR5 LFA-1 actif ICAM-1 DC-SIGN CD2 TCR Naive T lymphocyte ACTIVATION Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN-expressing cells bind CMV on their surface 100 DC-SIGN expression parental THP-1 80 DC-SIGN+ THP-1 60 MD-DC 2 anti-CMV gB (MFI) parental THP-1 40 20 252 THP-1 DC-SIGN 200 50 12.5 low pH 3.125 CMV concentrations (PFU/cell) 107 MD-DC DC-SIGN+ cell anti-DC-SIGN CMV particle Master 2 Immunologie - 03/10/2007

anti-DC-SIGN or control Flux cytometry analyses « trans-infection » principle DC-SIGN DC medium anti-DC-SIGN or control DC treatment EDTA mannan + AD169-GFP DC DC DC DC DC DC washes Cell contact with MRC5 Flux cytometry analyses DC-SIGN PE Master 2 Immunologie - 03/10/2007 GFP

DCSIGN-dependent trans-infection of CMV permissive cells 30 25 20 MRC5 cells % GFP+ 15 MD-DC 10 5 CMV - + pre-treatment - - E G T A mannan anti DC-SIGN control mAb 70 60 DC-SIGN+ 50 parental THP-1 cells MRC5 cells % GFP+ 40 30 20 10 CMV - + pre-treatment - - E G T A mannan anti DC-SIGN control mAb Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN mediates CMV trans-infection but does not allow transmission of other herpesviruses herpesvirus-pulsed DC-SIGN+ THP-1 cell-free viruses 40 120 100 30 80 IEA-EA+ cells (×103) 20 IEA-EA+ cells (×103) 60 40 10 20 VZV VZV AD169 Towne HSV-1 TB40/E AD169 Towne HSV-1 TB40/E medium anti-DC-SIGN control mAb Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN potentiates CMV trans-infection of MRC-5 cells B MD-DC THP-1 cells 30 40 25 30 20 % GFP+ MRC5 cells 15 % GFP+ MRC5 cells 20 10 10 5 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 MOI MOI cell-free virus cell-free virus parental THP-1 MD-DC DC-SIGN+ THP-1 +anti-DC-SIGN +anti-DC-SIGN +control mAb +control mAb Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN allows CMV to retain long term infectivity 60 50 40 cell-free virus % GFP+ MRC5 cells 30 parental THP-1 20 DC-SIGN+ THP-1 10 +anti-DC-SIGN 2 4 6 8 Time after pulse (days) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Requirement of DC-SIGN cytoplasmic domain for CMV transmission B C DC-SIGN expression membrane bound CMV 50 140 100 40 37°C 120 80 100 4°C anti-DC-SIGN (MFI) anti-CMV gB (MFI) 60 30 80 % GFP+ MRC5 cells 60 40 40 20 20 20 10 wt 20 35 wt 20 35 THP-1 THP-1 THP-1 DC-SIGN THP-1 DC-SIGN wt 20 35 THP-1 THP-1 DC-SIGN wt 20 35 YXXL YXXL LL Master 2 Immunologie - 03/10/2007

CMV internalization into MDDC is dependent on Temperature t=20min 4°C 37°C low pH treated untreated B DAPI DC-SIGN CMV Merge Figure 1 : Confocal imaging of immature MDDC (day 5-7 of differentiation) incubated for 2 hours at 4°C with TB40/E HCMV (20 pfu/cell) before a 1 hour subculture at 4°C or 37°C and a low pH treatment (glycine buffer, pH=3) and extensive washes. Cells were then immobilized on poly-L-lysine glass slides, fixed/permeabilized and immuno-stained with an anti-CMV gB. Images were obtained on a SP5 LSM (Leica Microsystems, Germany). Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Whole HCMV is internalized into early endosomes B TfnR LAMP2 EEA1 5 min. 30 min. 180 min. HCMV gB Whole HCMV 15 min. 75 min. gB LAMP2 Figure 2 : A) Confocal imaging of immature MDDC incubated for 5, 30 and 180 minutes with the TB40/E HCMV strain (20 pfu/cell) prior to be fixed/permeabilized and immuno-stained with anti-DC-SIGN (blue), -transferrin receptor or -EEA1 or -LAMP2 (green), and -CMV gB (red). B) As dexcribed in A, cells were incubated with whole HCMV or purified recombinant HCMV gB (Biomérieux, Marcy l ’Etoile, FRANCE) for 15 and 75 minutes prior staining of gB (red) and LAMP2 (green). Images were obtained on a 510 LSM Meta (Zeiss, Germany). Master 2 Immunologie - 03/10/2007

CMV is internalized by phagocytosis into MDDC Master 2 Immunologie - 03/10/2007 F. Halary et SERCOMI, Université Bordeaux 2.

DC-SIGN expression renders low susceptible cells permissive to CMV infection A B IE and E antigens expression CMV progeny 600 5 X23 500 4 400 X16 number of IEA-EA+ cells/104 cells virus progeny (x105 PFU/ml) 3 300 X10 2 200 1 100 parental DC-SIGN+ parental DC-SIGN+ MD-DC MD-DC MRC-5 THP-1 cells THP-1 cells control mAb anti-DC-SIGN medium Master 2 Immunologie - 03/10/2007

What is the ligand ? Master 2 Immunologie - 03/10/2007

CMV gB competes with HIV gp120 for DC-SIGN untreated 119 HIV-1 gp120 mannan anti-DC-SIGN untreated 20 14 18 6 parental THP-1 DC-SIGN+ THP-1 ctrl mAb CMV gB HSV-1 gB 123 35 102 VZV gB HSV-1 gD VZV gE 123 111 132 Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN+ cells can bind recombinant soluble CMV gB 120 100 80 DC-SIGN+ THP-1 60 40 20 no mAb 1 0.05 20 CMV gB binding (MFI) 0.0025 ctrl anti-DC-SIGN 60 50 40 30 MD-DC 20 10 1 0.05 20 0.0025 CMV gB concentrations (µg/ml) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Characterization of the DC-SIGN/ CMV gB interaction by SPR (BIAcore) Surface Plasmon Resonance Viral envelope glycoprotein Soluble DC-SIGN (monomers) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

concentrations (µg/ml) glycoprotein binding (MFI) A DC-SIGN homologue, DC-SIGNR, displays similar functional features towards CMV A +DC-SIGN 30 +DC-SIGNR 25 20 HEK 293T cells % GFP+ 15 10 ctrl 5 B Control +DC-SIGN +DC-SIGNR CMV gB 0.005 concentrations (µg/ml) glycoprotein 0.05 HIV gp120 0.5 5 ctrl 50 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 100 glycoprotein binding (MFI) Master 2 Immunologie - 03/10/2007

UMR CNRS 5164 (Bordeaux) J Déchanet-Merville, JF Moreau Acknowledgment UMR CNRS 5164 (Bordeaux) J Déchanet-Merville, JF Moreau Institut Pasteur (Paris) A Amara, F Arenzana-Seisdedos IBS (Grenoble) H Lortat-Jacob, C Houlès, F Fieschi University of Halle-Wittenberg (Allemagne) M Messerle INRA (Villenave d ’Ornon) T Delaunay Aventis-Pasteur (Lyon) C Méric Master 2 Immunologie - 03/10/2007