Les Lymphocytes B Dr: N. OUIKHLEF EHU D’ORAN 2014-2015

Le système immunitaire Les organes lymphoïdes Les cellules Les organes lymphoïdes Les protéines Réponse immunitaire

Les cellules du système immunitaire Spécifiques: LT, LB Non spécifiques: NK, MФ, PN, CD… LT >>>> réponse immunitaire cellulaire spécifique LB>>>> réponse immunitaire humorale spécifique « Help »

Les lymphocytes B (LB) Les lymphocytes B (LB) sont le support de l’immunité humorale adaptative. Représentent 5-10% des lymphocytes sanguins. Reconnaissent les antigènes (Ag) grâce à leur récepteur de surface spécifique de l’Ag : BCR (B Cell Receptor). Reconnaissance induisant, le plus souvent, l’activation et la différenciation des LB en plasmocytes et en LB mémoires.

I. ONTOGENIE DES LB

ONTOGENIE Chez l’homme, les cellules B se développent à partir des cellules souches hématopoïétiques: Du foie fœtal: site principal de développement des cellules B durant la vie fœtale. Cellules pre-B : 8ème semaine de gestation; Cellules B immatures : 9ème semaine de gestation; Cellules B matures : 12ème semaine de gestation. De la moelle osseuse: qui prend le relai en milieu de gestation et continue durant la vie adulte.

Cellule souche hématopoïétique ONTOGENIE Rappel sur l’hématopoïèse : Cellule souche hématopoïétique Précurseur myéloïde Précurseur lymphoïde Mégacaryocyte Erythrocyte Granulocyte Monocyte Lymphocytes La différenciation des LB se fait à partir des cellules souches hématopoïétiques qui ont la capacité de s’auto renouveler. Ces cellules donnent naissance aux différentes lignées hématopoïétiques. Ces CSH se différencient en progéniteur myéloïde commun (CMP) et en progéniteur lymphoïde commun (CLP). Le CLP donne naissance au différentes cellules lymphoïdes : LB, LT, NK et DC.

))) ONTOGENIE Différenciation et maturation des LB : Progéniteur Lymphoïde Pro-B Pré-B B immature B transitionnel B mature B mémoire Plasmocyte commun ))) La maturation du LB passe par plusieurs stades évolutifs. 2 grandes étapes de maturation du LB: étape indépendante de l’Ag ou lymphopoïèse qui se fait au niveau de la moelle osseuse et étape dépendante de l’Ag ou immunopoiese qui se fait dans les organes lymphoïdes périphériques. Différenciation indépendante de l’Ag -LYMPHOPOEISE- Moelle osseuse Différenciation dépendante de l’Ag -IMMUNOPOEISE- Organes lymphoïdes périphériques Circulation (RATE)

LA LYMPHOPOÏÈSE

Progéniteur lymphoïde commun (CLP) LA LYMPHOPOÏÈSE CD 34⁺ CD 10⁺ CD 34⁺ CD 10⁺ CD 19⁺ Cellule pre-pro B Progéniteur lymphoïde commun (CLP) TdT⁺ RAG⁺ CD 34⁺ CD 10⁺ CD 19⁺ Cellule pro-B Moelle osseuse Cellule pré-B large TdT⁻ RAG⁻ Cμ⁺ SLC⁺ CD 10⁺ CD 19⁺ CD 20⁺ μ Cellule pré-B small Cellule B immature RAG⁺ Cμ⁺ SLC⁻ CD 10⁺ CD 19⁺ CD 20⁺ IgM⁺ CD 10⁺ CD 19⁺ CD 20 ⁺ μ Expansion clonale

Plusieurs facteurs influencent la lymphopoïèse : Le microenvironnement médullaire ; Le pré-BCR ; Les facteurs de transcription.

Rôles du microenvironnement médullaire : LA LYMPHOPOÏÈSE Rôles du microenvironnement médullaire  : C-Kit SCF VLA-4 VCAM-1 La prolifération et la différenciation des proB en pré nessécite un microenvironnement fourni par les cellules stromales de la MO: Les cellules stromales jouent 2 rôles importants: Elles entrent directement en interaction avec les cellules proB. Cette interaction est médiée directement par les molécules d’adhésion cellulaire: VLA-4 exprimé à la surface du proB et son ligand le VCAM-1 à la surface de la cellule stromale. Après qu’un contact initial ait été établi, le récepteur c-Kit à la surface du pro-B entre en interaction avec le SCF à la surface de la cellule stromale qui est le facteur de croissance des cellules souches. Cette interaction active le c-Kit qui est une tyrosine kinase et la cellule pro-B commence à se diviser et se différencier en cellule pré-B. Contact direct Facteurs sécrétés (solubles)

Fig n°1: Structure du complexe du pré-BCR LA LYMPHOPOÏÈSE Le pré-BCR : Le pré-BCR : Chaine lourde μ ; SLC (Surrogate Light Chain) ou chaine légère de substitution. La SLC : une glycoprotéine de structure semblable à celle de la chaine légère des Ig. Formée par : La protéine λ-like (ou λ 5 chez la souris). La protéine VpreB. Fig n°1: Structure du complexe du pré-BCR

LA LYMPHOPOÏÈSE Rôles du pré-BCR : Différentiation et prolifération des cellules pré-B. Arrêt des réarrangements de la chaine μ. Réarrangement des gènes de la chaine légère. Activation Constitutive (basale) Interaction avec un ligand extracellulaire (famille des galectines) Fig n°2 : Activation du pré-BCR

Implication des facteurs de transcription : LA LYMPHOPOÏÈSE Implication des facteurs de transcription : CSH* MLP* CMP CLP Pro-B précoce tardif Pré-B LB immature GATA-2 PU.1 +++ E2A EBF Pax-5 IKAROS Paired box protein 5 (PAX5) *cellule souche hématopoïétique *major late progenitor Un ensemble de facteurs de transcription régulent la différenciation précoce des LB

II. LA SÉLECTION CENTRALE ET PÉRIPHÉRIQUE

Cellules B avec BCR fonctionnels Cellules B avec BCR autoréactifs LA SÉLECTION CENTRALE ET PÉRIPHÉRIQUE Sélection centrale (MO) Sélection positive Sélection négative Cellules B avec BCR fonctionnels Cellules B avec BCR autoréactifs La  tolérance centrale : Seuls les lymphocytes B qui ont un récepteur fonctionnel reçoivent des signaux de survie (sélection positive). Cette étape est marquée par une diminution significative des auto-Ac (75-40%) et des Ac polyréactifs. Cependant le mécanisme exact de la sélection n’a pas encore été défini chez l’homme. La moelle osseuse est donc à la fois le lieu de naissance et le cimetière de nombreux lymphocytes B, non fonctionnels ou auto-réactifs. La tolérance périphérique : Seulement 10-20% des LB immatures rejoignent la rate chaque jour et seulement 5-10% vont devenir des LB naïfs matures. La maturation périphérique du LB conduit à la diminution du nombre de cellules autoréactives de 50%. Cependant une fraction significative des LB naïfs matures à niveau bas d’autoréactivité persistent ainsi que les LB polyréactifs. Cette étape de maturation est indépendante de la rencontre d’un antigène. La réussite de chaque étape de ce programme complexe conditionne la survie lymphocytaire B. Receptor editing Délétion Anergie

Maturation des LB au niveau de la rate LA SÉLECTION CENTRALE ET PÉRIPHÉRIQUE Rate LB immature LB immature IgM High IgD ⁻ CD 21⁻ CD 23⁻ LB T1 IgM High IgDlow CD 21low CD 23 High Une petite proportion de cellules B deviennent LBZM ZM: région qui se trouve a la limite de la pulpe blanche LB ZM LB T2 Moelle osseuse IgM High IgD High CD 21 High CD 23low Rate IgM High IgD ⁺ CD 21⁺ CD 23 ⁺ LB folliculaire Maturation des LB au niveau de la rate

III. SOUS POPULATIONS DES LB

En 1986 2 sous populations selon l’expression de CD5. SOUS POPULATIONS DES LB Classification des LB : Classification 1: En 1986 2 sous populations selon l’expression de CD5. LB CD5⁺ LB CD5⁻ Utile pour les hématologistes pour différencier les différents types de lymphomes et leucémies chez l’homme. Les différentes sous populations différent par: taille, marqueurs de surface et localisation B1 et LBZM plus grand que les folliculaires

LB SOUS POPULATIONS DES LB Classification 2: LB B1 Foie fœtal LB B1a (CD5⁺) Cavités séreuses LB B1b (CD5⁻) Cavités séreuses LB B2 (LB conventionnels) MO LB folliculaires (LB F) OLS+circulation LB de la zone marginale (LB ZM) Rate Les différentes sous populations différent par: taille, marqueurs de surface et localisation B1 et LBZM plus grand que les folliculaires

SOUS POPULATIONS DES LB Fonction: B1a Ac naturels B1b Ac contre les Ag thymo-indépendants. 5% de la population totale des LB Localisation: Cavités séreuses (pleurales et péritonéales). Cellules innate-like. Les LB B1 Origine: fœtale Population qui s’autorenouvelle. Phénotype : IgM High, IgD low et CD11 b

Fonction : réponse aux polysaccharides bactériens. SOUS POPULATIONS DES LB LB de la zone marginale Fonction : réponse aux polysaccharides bactériens. Fonctions: Réponse aux antigènes thymo-dépendants. Formation des centres germinatifs. Précurseurs des LB mémoires et des plasmocytes. LB Folliculaires Les LBZM sont différents des LB mémoires à IgM présentes du sang périphérique issues des réponses T dépendantes, dont le phénotype est : IgM High, IgD - et CD 27+. Similitudes avec leurs équivalents chez la souris: Différence : présence d’hypermutations somatiques au niveau des gènes d’Ig et capacité de recirculer.

IV. MARQUEURS DE SURFACE DU LB

MARQUEURS DE SURFACE DU LB Le complexe BCR est formé par: Un module de reconnaissance : Ig de membrane. Un module de transduction des signaux : Hétérodimère Igα (CD79a) et Igβ (CD79b). Codées respectivement par b29 et mb1. Cette structure assure la reconnaissance de l’Ag et la transduction des signaux d’activation via les motifs ITAM des extrémités de l’hétérodimère Igα/Igβ. Dans une cellule, la membrane contient environ 1,5 105 molécules d’Ac. Fig. : Complexe BCR

MARQUEURS DE SURFACE DU LB Ig de surface CD19 CD22 CD40 CD21 HLA II CD80 CD86 Igα Igβ Igα Igβ CD20 CD81 Le LB exprime différents TLR : TLR2, TLR-4 et TLR-6.

V. ACTIVATION ET DIFFERENTIATION DES LB

ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB Prolifération Différenciation Antigène Antigènes thymo-indépendants (Ag TI) Antigènes thymo-dépendants (Ag TD) En absence d’activation induite par un Ag les LB naïfs de la périphérie ont une durée de vie courte et meurent en qlq semaines par apoptose. Ag TI de type 1 Activateurs polyclonaux (mitogènes) Ex: LPS Ag TI de type 2 Molécules à motifs répétitifs Ex: flagelline bactérienne Ag protéiques

ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB Réponse aux antigènes thymo-indépendants (Ag TI) Réponse aux antigènes thymo-dépendants (Ag TD) Mémoire immunologique Formation decentre germinatif IgM, puis IgG ou IgA ou IgE ++ Switch vers les autres classes d’Ig Hypermutation somatique >> forte affinité Pas de mémoire Pas de centre germinatif IgM+++ Pas de switch Pas d’hypermutation somatique En absence d’activation induite par un Ag les LB naïfs de la périphérie ont une durée de vie courte et meurent en qlq semaines par apoptose.

ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB

Rôle du corécepteur du LB pour l’activation ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB Rôle du corécepteur du LB pour l’activation

Réponse extrafolliculaire: ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB Réponse aux Ag TD : le « help » des LT Réponse extrafolliculaire: Plasmocytes à IgM (Ig non mutées) CD 40 CD40L Réaction du centre germinatif: Plasmocytes de haute affinité; LB mémoires (Ig mutées) Les LBn entrent dans les follicules primaires des organes lymphoïdes secondaire. Ces LB subissent une prolifération rapide et forment le centre germinatif. Génération d’Ac de haute affinité spécifiques de l’Ag.

Formation du centre germinatif ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB: Ag TD Réponse aux Ag TD  « Formation du centre germinatif » Formation du centre germinatif Ac de haute affinité Les LB activés entrent dans les follicules primaires des organes lymphoïdes secondaire. Ces LB subissent une prolifération rapide et forment le centre germinatif. Génération d’Ac de haute affinité spécifiques de l’Ag. Hypermutation somatique Commutation isotypique de l’affinité Acquisition de nouvelles fonctions biologiques

ACTIVATION ET PROLIFERATION DES LB Manteau folliculaire (LB naïfs) Réseau de FDC résiduelles Zone claire Centre germinatif LB naïfs FDC Manteau folliculaire: LB naïfs IgM+ IgD+ Zone sombre FOLLICULE PRIMAIRE FOLLICULE SECONDAIRE (phase 1: 1 à 4j après immunisation) FOLLICULE SECONDAIRE (phase 2: 4 à 21j après immunisation) FOLLICULE SECONDAIRE (phase 3: 21j à plusieurs semaines après immunisation) FDC : cellule dendritique folliculaire PHASES DE LA REACTION FOLLICULAIRE

ACTIVATION ET PROLIFERATION DES LB LB M LTh F CC PC ZONE CLAIRE APICALE Commutation de classe et maturation en cellules mémoires ou en plasmocytes CC FDC CXCL-13 LB CG FDC CXCL-13 ZONE CLAIRE BASALE ZONE CLAIRE BASALE LB CG CC LTh F LTh F Sélection des centrocytes de haute affinité Sélection des centrocytes de haute affinité CXCR-5 CXCR-5 Apoptose Apoptose LB CG CB ZONE SOMBRE ZONE SOMBRE CB CXCR-4 LB CG CXCR-4 Mutation somatique dans les centroblastes en prolifération Mutations somatiques dans les centroblastes en prolifération au niveau des régions VL et VH Cellules stromales CXCL-12 Cellules stromales CXCL-12 CB LB CG

Cytokines intervenant dans le choix de classe de l’Ig ACTIVATION ET DIFFERENCIATION DES LB Commutation isotypique : Différentes cytokines Cytokines intervenant dans le choix de classe de l’Ig

VI. LES PLASMOCYTES ET LES LB MÉMOIRES

L’IMMUNOPOIESE Centre germinatif LB mémoire (Igs mutées) centrocyte La réaction du centre germinatif aboutit a la formation des LBm et des PC. centroblastes Plasmocytes (Igs mutées)

Facteurs impliqués dans la différenciation plasmocytaire PLASMOCYTES Facteurs impliqués dans la différenciation plasmocytaire Plasmoblaste Plasmoblaste Plasmocyte LB activé Plasmoblaste Plasmoblaste Plasmoblaste IL-2 IL-10 IL-6 Engagement des LB activés dans la voie de différenciation plasmocytaire Prolifération et survie des plasmoblastes Les PC ne se divisent pas. PC à courte durée de vie meurent après une à deux semaines de leurs différenciation. Cellules spécialisées dans la sécrétion d’Ac: Perte d’expression : CD19, CD20, CD21, CD22 et CMH II peuvent secréter plusieurs centaines a plusieurs milliers d’Ac par seconde.

Localisation des PC à longue durée de vie : PLASMOCYTES Localisation des PC à longue durée de vie : Stroma médullaire Centre germinatif Cellules stromales: VCAM-1 VLA-4 ))) PC Syndecan-1 CXCR-4 CXCL-12 Localisation : MO 90% des PC IgG⁺ CD 138⁺ sont retrouvés à proximité des cellules stromales

PLASMOCYTES Moyens de survie des PC à longue durée de vie : Survie: PC maintenus en dehors de toute stimulation antigénique. BCMA (B cell maturation Ag) hautement exprimé par PC facteur de survie des plasmocytes à longue durée de vie. BCMA récepteur de forte affinité de APRIL (a proliferating-inducing ligand) PC isolés de la moelle osseuse chez l’homme expression facteurs anti- apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 Augmentation de l’expression de BCMA durant les stades terminaux de la différenciation des LB.

LB MEMOIRES Les LB du CG qui expriment des BCRs de haute affinité sont sélectionnés positivement et quittent le centre germinatif pour entrer dans le compartiment des LB mémoires. Support de la réponse secondaire. Recirculent dans organes lymphoïdes et dans le sang.

Critères de définition des LB LB MEMOIRES Critères de définition des LB Critères phénotypiques : Perte d’expression d’IgD (non valide, il existe des LB mémoires IgD⁺). Expression de CD27 (marqueur spécifique des LB mémoires chez l’homme). Critères fonctionnels : Capacité de générer une réponse Ac accélérée et de forte amplitude (susceptible de conférer une protection après une injection de rappel). Critères moléculaires : Gènes VH et VL mutés (reste le meilleur critère de définition)