Plusieurs types de division cellulaire Cellules somatiques Cellules embryonnaires Cellules germinales : ovocytes 1mm Vésicule germinale (noyau) Levures 1mm Globule polaire division 1mm Cellules humaines en culture Embryon de Xenope après 4-5 divisions au stade 8-10 blastomères (ou cellules) Figure 1.1 Première division méiotique chez un Ovocyte humain, Xenope, etoile de mer…

Embryon précoce de Drosophile 8 minutes Embryon précoce de Xenope 30 minutes Embryon précoce d’Oursin 60 minutes Schizosaccharomyces pombe ou levure du boulanger ou « fission yeast » 60 minutes Saccharromyces cerevisiae ou levure de bière ou « budding yeast » 90 minutes Cellule humaine en culture 18 heures Figure 1.2 : Durée des divisions cellulaires dans divers types de cellules.

S G1 G2 M INTERPHASE MITOSE Croissance Phase Go Croissance et réplication de l’ADN S Croissance et Derniers préparatifs en vue de la division G1 G2 Croissance Point de restriction M Cytocinèse Prophase Prométaphase Télophase Anaphase Métaphase Phase Go MITOSE Figure 1.3.1 : Evènements observables durant les phases du cycle cellulaire.

Interphase Interphase Métaphase noyau réticulum endoplasmique golgi En fin d’anaphase les membranes vésiculaires mixtes de noyau et de réticulum se reforment progressivement à partir de leur organisation autour de la chromatine. Les vésicules de golgi fusionnent pour reformer l’organite. Dans les cellules HeLa environ 130 vésicules (ou fragments de golgi) d’un diamètre moyen de 60 nm se dispersent dans le cytoplasme. Des vésicules mixtes de membranes denoyau et de reticulum de forment. Figure 1.3.2. : Devenir des organites au cours de la division cellulaire.

A B C D G1 S G2 M S M Volume cellulaire divisé par deux Nombre de chromosomes divisés par deux M Nombre de chromosomes multipliés par deux S Figure 1.4 : Variations des types de cycle cellulaire et des cellules produites.

Figure 1.5 : Succession des types de cycle cellulaire. Mitose de l’embryon précoce Mitose de l’embryon et adulte Méiose M M S M G1 S G2 M Figure 1.5 : Succession des types de cycle cellulaire.

(ou mort cellulaire programmée) Z Z Dégradation lente des fonctions cellulaires suivie de nécrose cellulaire C Sénescence post-réplicative F Quiescence ou phase G0 A Cycle de division cellulaire Fragmentation de le membrane plasmique B E Fragmentation de l’ADN nucléaire Cellule musculaire multinucléée D Cellules polarisées en brosse de l’épithelium du tube digestif Apoptose (ou mort cellulaire programmée) Différenciation Figure 1.6 : Place du Cycle cellulaire dans les destins cellulaires.

G1, S ou G2 M M A B + = ADN Métaphasique condensé ADN Interphasique: Chromatine ADN en réplication (incorporation de BrdU) G1 S S + = Figure 1.7 : Dominance cellulaire : Expériences de Rao et Johnson, 1970.

Fertilisation chez : Ascaris (nématode) Spisula (bivalve) Octopus (poulpe) Urechis (ver marin) Fertilisation chez : Chaetopteres (ver marin tubulaire) Mytilus (moule) Patella (patelle ou Bernique) Artemia (crustacé marin) Drosphila (mouche du vinaigre) Ascidia (tunicier marin ou violet) Fertilisation chez Presque tous les vertébrés Fertilisation chez : Arbacia (oursin) Tubularia (hydrozoaire) Vésicule germinale=VG = noyau de l’ovocyte 2ème globule polaire 1er globule polaire Rupture de la vésicule germinale = GVBD Noyau haploïde = pronucleus Chromosomes Fuseau VG Prophase I = Arrêt en G2 = Ovocyte immature GVBD = Germinal Vesicle Break Down = Ovocyte mature Metaphase I Metaphase II Pronucleus = Phase G1 Arrêt méiotique primaire Arrêts méiotiques secondaires Figure 1.8 : La maturation méiotique chez quelques espèces et les étapes de fertilisation provoquant l’accomplissement de la méiose.

Déclencheur de la maturation méiotique Vésicule germinale=VG = noyau de l’ovocyte Rupture de la vésicule germinale = GVBD 17, 20-dihydroxy 4-pregnen 3-one (Nagama et Adachi, 1985) VG Poisson rouge GVBD Progestérone (Fortune et al., 1975 ; Godeau et al., 1978) VG Rana pipiens; Xénope GVBD 1-Methyladenine (Kanatani et al., 1969) VG Etoile de mer GVBD Protéases (fluide digestif) (Peaucellier, 1977) VG Sabellaria alveolata GVBD Phase G2 Phase MI Figure 1.9 : Déclenchement hormonal de la maturation méiotique chez quelques espèces modèles.

Rupture de la vésicule germinale = GVBD Hormone induisant la maturation méiotique Vésicule germinale=VG = noyau de l’ovocyte MPF Progestérone VG VG Crapaud (Bufo sp.) (Dettlaf, 1964) A B C GVBD GVBD G2 M G2 M MPF Progestérone VG VG Grenouille (Rana pipiens) (Masui et Markert, 1971; Smith et Ecker, 1971) GVBD GVBD G2 M G2 M MPF 1-Methyladenine VG VG Etoile de mer (Kishimoto et Kanatani, 1976) GVBD GVBD G2 M G2 M Figure 1.10 : Emergence du concept MPF (Maturation Promoting Factor) après transfert de cytoplasme d’ovocytes activés par l’hormone de maturation chez diverses espèces.

Pas de maturation méiotique VG VG A VG G2 G2 G2 Progestérone B VG VG GVBD GVBD G2 M G2 M Progestérone Pas de maturation méiotique VG VG VG C G2 G2 G2 Incubation dans un milieu contenant du cycloheximide = blocage des traductions de protéines. Figure 1.11.1 : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971).

Traitement du cytoplasme contenant le MPF par des enzymes (DNase RNAse) ou dialyse. Progestérone VG VG GVBD GVBD G2 M G2 M Progestérone Pas de maturation méiotique VG VG VG E GVBD G2 M G2 G2 Traitement du cytoplasme contenant le MPF par des Protéases ou la chaleur. Figure 1.11.2 : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971).

Grenouille (Rana pipiens) B Masui et Markert, 1971 Grenouille (Rana pipiens) Kishimoto et Kanatani, 1976 Etoile de mer Progestérone 1-Methyladenine VG GVBD 100% VG GVBD 100% G2 M G2 M VG VG GVBD 69% GVBD 100% G2 M G2 M VG VG GVBD 91% GVBD 88% G2 M G2 M VG VG GVBD 75% GVBD 93% G2 M G2 M Figure 1.12 : Résumé des expériences de « transferts de cytoplasmes d’ovocytes activés » en série dans deux modèles d’étude (le pourcentage d’ovocytes receveurs qui atteignent le stade GVBD est indiqué).

Maturation de l’ovocyte G2 MI MII fertilisation 1ère Mitose 2ème mitose VG [MPF] = concentration de MPF Embryon 2 cellules VG 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 G2 M MPF ? 10 20 30 40 50 60 Maturation de l’ovocyte Divisions embryonnaires minutes Progestérone Fertilisation Figure 1.13 : Principe du test MPF de Masui et Markert Rana pipiens (1971).

MPF Progestérone Test MPF CSF VG VG GVBD GVBD G2 M G2 M MPF CSF ? fertilisation contrôle fertilisation Figure 1.14.1 : Principe des tests MPF et CSF de Masui et Markert chez Rana pipiens (1971).

Activité CSF ------ Activité MPF Temps VG G2 MI MII fertilisation Activité CSF ------ Activité MPF Arrêt G2 Meïose I Meïose II 1er cycle 2ème cycle embryonaire embryonaire Temps Figure 1.14.2 : Activité MPF et CSF mesurables au cours de la maturation méiotique par transferts de cytoplasmes dans des ovocytes ou des blastomères d’embryons précoces de. grenouille (Rana pipiens ) par Masui et Markert (1971).

Figure 1.15 : Chronogramme de l’identification du MPF. Année Modèle méiotique Modèle somatique Modèle embryonnaire Découverte de la transformation automatique d’un ADN exogène en ADN d’ovocyte (Dominance) après microinjection (Oursin, Amphibien). 1922-1929 1964 Synchronisation du cycle cellulaire chez Tetrahylmena. 1967 Découverte de l’hormone de maturation des amphibiens. 1969 Découverte de l’hormone de maturation de l’Etoile de mer. 1970 Dominance des phases S et M du cycle cellulaire (Cellules HeLa). 1964-1971 Découverte du MPF (Amphibiens). 1971 Découverte du CSF (Amphibiens). 1974 Premiers mutants cdc de S. cerevisiae (Levure) 1975 Premiers mutants cdc de S. pombe (levure) 1976 Découverte du MPF d’Etoile de mer. Gene Cdc2 requis pour l’entrée en phase M de S. pombe (Levure) 1976 Elévation des phosphorylations de protéines au cours de l’entrée en méiose (Etoile de mer). 1980 Nécessité d’ATP pour l’activité MPF. 1978-1982 Universalité du MPF en méiose. 1979-1982 Découverte du MPF dans cellules HeLa et chez S. cerevisiae 1982 Les gènes cdc2 (S. pombe) et CDC28 (S. cerevisiae) sont équivalents. 1982-1986 Identification et clonage de la 1ère Cycline (Oursin). 1983 Oscillations parralèles du MPF et des phosporylations de protéines (Etoile de mer). Nécessité de synthèses de protéines au MPF pour pouvoir se régénérer (Xenope). Découverte du MPF en mitose (Xenope). 1984 1985-1986 Purification du MPF de Xenope Les gènes CDC28 et cdc2 codent pour une protéine kinase (Levures). 1987 Clonage du gène cdc2 humain. 1988 Purification du MPF (Xenope) . Purification de l’Histone H1 kinase (Etoile de mer). Identification de cdc2 dans le complexe MPF-H1 kinase de Xenope et d’Etoile de mer (western blot). 1989 Le MPF = complexe stoechiométrique entre une sous-unité cycline et une sous-unité P34cdc2 (Etoile de mer). 1990-1991 Homologues de cdc2 identifiés dans divers modèles et adoption d’une nouvelle nomenclature des protéines da la famille de cdc2= CDK1. 2001 Paul Nurse, Leland Hartwell et Tim Hunt partagent ensemble le prix Nobel de Médecine pour leurs découvertes respectives des régulateurs de la division cellulaire. Figure 1.15 : Chronogramme de l’identification du MPF.

Densitométrie de la cycline SDS-PAGE Protéines radioactives Cycline Collecte d’échantillons toutes les 10 minutes et traitement dans l’acide trichloroacetique pour fixation puis migration sur gel SDS-PAGE, séchage et autoradiogramme. Densitométrie de la cycline 3 2 1 Fertilisation des ovocytes dans l’eau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines. Minutes 10 30 50 70 90 110 130 Le second pic de synthèse de Cycline est moins important à cause de la dilution de la [35S]methionine rajoutée au début de l’expérience. Figure 1.16.1 : Expérience d’identification de la première cycline dans l’embryon d’Oursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt 1983.

Collecte d’échantillons toutes les 10 minutes et traitement comme pour la Figure 1.17.1. Fertilisation des ovocytes dans l’eau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines. Quantité de Cycline (- -) % d’embryons en division ( ) 2 1 50 25 0 1 2 Heures après fertilisation Figure 1.16.2 : Expérience d’identification de la première cycline dans l’embryon d’Oursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt 1983.

CDC2 kinase CDC2 kinase CDC2 kinase CDC2 kinase wee1 cdc25 CDC2 kinase Phénotype de division normal CDC2 kinase Phénotype de division Wee CDC2 kinase Phénotype de division cdc25 Phénotype de division de type catastrophe mitotique = Entrée en phase M avant la fin de la phase S = Totale désynchronisation des phases S et M. CDC2 kinase Légende : Effet inhibiteur Délétion du gène Effet activateur Surexpression du gène Figure 1.17 : Mutants cdc de Levure (Schizosaccharomyces pombe) isolés par Paul Nurse à partir de 1976 : Réseau de régulation en amont de cdc2.

N- -C Cdc2 Levure N- -C Cdc2 Humain Banque d’ADNc humains (Labo. Hirota Okayama) Culture de mutant cdc2ts de S. pombe À la température permissive= divisions Transfection des levures cdc2ts avec l’ADN de la banque Observation des colonies de Levures cdc2ts à T° restrictive Repiquage des colonies de levures qui arrivent à pousser N- -C Cdc2 Levure 63% d’identité N- -C Observation au microscope d’une colonie de Levure à T° restrictive. Cdc2 Humain Levures de taille normale sans phénotype cdc2ts = phénotype normal. Isolement et séquençage du plasmide de la banque d’ADNc Humain présent dans le clone de Levure. Identification du produit codé par l’ADNc responsable de la complémentation fonctionnelle de la mutation cdc2ts (perte de fonction) par comparaison de séquence aminoacides. Levure de grande taille ayant perdu le plasmide et incapable de se diviser = phénotype cdc2ts. Figure 1.18 : Clonage de l’homologue humain de cdc2 par complémentation focntionnelle, Lee et Nurse, 1987.