HEMOPHILIE: la place du laboratoire JF SCHVED Centre Régional de Traitement des Hémophiles Laboratoire d’Hématologie CHU Montpellier

HEMOPHILIE: la place du laboratoire Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs

SYNDROME HEMORRAGIQUE: BILAN 4 Examens: Numération plaquettaire Temps de Quick (‘‘TP’’) Temps de Céphaline + activateur Fibrinogène

ALLONGEMENT DU TEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEUR Quand parler d’allongement du temps de céphaline + activateur Toujours en référer au «temps du témoin», que le laboratoire doit indiquer Temps de céphaline + activateur anormal si TCA malade TCA Témoin > 1,2* * Chez l’enfant: 1,3

EXPLORATION DE LA COAGULATION Activateur XII VII XI IX VIII PL V X II I Caillot

Temps de Quick Facteur tissulaire XII VII XI IX VIII V X II I Caillot Calcium XII VII XI IX VIII PL V X II I Caillot

Temps de céphaline +activateur acide ellagique silice kaolin Calcium XII VII XI IX VIII Céphaline V X II I Caillot

TCA TQ Nl XII XI IX VIII VII X II I V

Avec syndrome hémorragique TCA TQ Nl Avec syndrome hémorragique XII XI IX VIII VII X II I V

FACTEUR VIII : Différentes techniques de dosage Dosage fonctionnel (activité) Chronométrique Chromogénique Dosage de la protéine (antigène)

HEMOPHILIE: la place du laboratoire Le dosage du facteur VIII Réactifs: Plasma déficient en facteur VIII Réactif TCa Calcium Principe Droite d'étalonnage: dilutions en tampon pH 7,35 Dilution 1/20 (100%), 1/40 (50%), 1/80 (25%), 1/160 (12,5%), 1/320 (6,5%) Dilutions du plasma à tester

DOSAGE FACTEUR VIII Sec 78,6 O O 1/4 68,6 O O 1/2 60,3 O O 1/1 53,6 O 48,1 O 4,55 11,38 22,75 45,5 91,0 Concentrations (%)

VARIABLES PRE-ANALYTIQUES Tube: type, anticoagulant, remplissage.., hématocrite.. Prélèvement: garrot, matériel à prélèvement, cathéter, place du tube.. Transport: délai, température.. Conditionnement au labo: centrifugation, congélation, conservation, décongélation..

DOSAGE CHRONOMETRIQUE du FVIII Facteurs influençant la précision: Appareillage TCA : réactif utilisé Plasma déficient contenant tous les facteurs sauf FVIII (Plasma humain lyophilisé) Plasma à tester dilué: 2 dilutions extemporanées (1/10; 1/20 +++)

F VIII: Contrôle de Qualité ECAT moyenne CV % limites Votre résultat Groupe total 156 11.5 35.7 4-30 10 Test en 1 temps Test en 2 temps 141 11.7 10.9 35.9 11.9 5-30 9-14 Activateur Actin FSL Pathromtin SL PTT autom. stago 21 14 26 11.3 17.5 10.6 22.1 43.4 20.8 8-16 6-15 ECAT n° 2/2005

avec syndrome hémorragique TCA TQ Nl avec syndrome hémorragique Déficit biologique Facteur VIII Hémophilie A congénitale Hémophilie acquise Maladie de Willebrand Déficit biologique Facteur IX Hémophilie B congénitale Hypovitaminose K partielle ou débutante Déficit biologique en facteur XI Déficit congénital en facteur XI

Classification des hémophilies Taux de facteur Classification < 0.01 IU/ml (< 1%) sévère 0.01-0.05 IU/ml (1%-5%) modérée > 0.05- < 0.40 IU/ml (> 5%-< 40%) mineure 1 IU/ml = 100% World Health Organization International Standard Valeurs normales = 50- 150% (établies dans chaque laboratoire) T & H 2001 Scientific subcommittee on FVIII and FIX

HEMOPHILIE: la place du laboratoire Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs

PHARMACOCINETIQUE - Récupération : Taux maximal et evolution dans le temps du taux de FVIII ou IX dans le sang circulant après une perfusion d’une quantité donnée de facteur anti-hémophilique. - Demi-vie : Temps au bout duquel il reste 50 % du taux maximum de FVIII ou IX circulant.

CINETIQUE FAH: Protocole Doses à injecter prélèvements -pour le FVIII : 25 U/kg -pour le FIX : 50 U/kg -avant le prélèvement -à 10 min -à 30 min -à 1h -à 6h -à 12 h -à 24h

DOSAGE F VIII pour CINETIQUE Technique: Méthode de coagulation en 1 temps Particularités Dosage de Refacto R Préférer le dosage chromogénqique Standard Refacto

CINETIQUE F VIII FVIII; ½ vie 8 h Récupération 2U/dl/U/kg; Injection de 25UI/kg FIX; ½ vie 12 h Récupération 1U/dl/U/kg

EXEMPLE DE CINETIQUE F VIII Patient de 90 Kg Activité F VIII (en %) FVIII 2250 UI 60 49 - Calcul de la récupération = (49-1)x90 : 2250 = 1.92 % par U/ kg 50 40 30 20 - Demie vie = 9 h 10 1 5 10 15 20 25 30 Temps en heures

Pharmacocinétique: limites Méthodes de dosage FVIII:C et FIX:C Recommandations FVIII/FIX subcommittee of SSC of the ISTH Récupération in vivo Volume de distribution = vol. plasmatique du patient Faux pour le FIX non constant dans le temps activation post-perfusion Demi-vies 2 ou 3 phases Rapide = équilibre distribution vol. plasmatique (3-6h) Plateau = taux initial Finale = dégradation du FVIII (15-17h)

HEMOPHILIE: Les inhibiteurs Diagnostic Suivi thérapeutique Dépistage des complications: inhibiteurs

DEPISTAGE des INHIBIBITEURS: Quand le faire? Systématiquement tous les 3 mois ou toutes les 5-10 substitutions chez l'hémophile sévère et jusqu'à 100 jours cumulés d'exposition au produit (JCPA), puis 1-2 fois par an Avant (15j) et après une chirurgie ou un traitement intensif Inefficacité ou efficacité partielle d'une perfusion de FAH

Mise en évidence d'un inhibiteur: comment? Mise en évidence d'un effet inhibiteur in vitro Bethesda Courbe de récupération

Les premières méthodes Principe : mesure de la capacité à inhiber l’activité procoagulante du FVIII Dépistage puis Titrage Qualitatif : dilution de plasma contenant l’inhibiteur + quantité fixe de FVIII New Oxford 1973 Bethesda 1975 Plasma concentré Pool de plasma normaux

DEPISTAGE des ANTI F VIII Incubation (1:1, 2 h à 37°) : Plasma titré à 100% de F VIII + plasma à tester Plasma titré à 100% + tampon Dosage du FVIII résiduel Dans le mélange plasma 100% + plasma à tester Dans le mélange plasma 100% + tampon Dans ce mélange, le taux de VIII attendu est environ de 50% Interprétation La présence d’un anti VIII se traduit par une diminution du taux de FVIII dans le mélange « référence+malade » En l’absence d’Ac le taux de FVIII est identique a celui retrouvé dans le mélange « référence+tampon »

Biologie: Dépistage anti FVIII Plasma titré à 100% T° 1 vol. 1 vol. 1 vol. 1 vol. Plasma malade Tampon < 50 % de FVIII 50% de FVIII

TITRAGE de l'Anti FVIII (Bethesda) Taux de FVIII résiduel (malade+référence) Taux de FVIII résiduel (tampon+référence) Taux de FVIII résiduel corrigé Taux résiduel corrigé reporté sur un abaque reliant les UB et les taux résiduels corrigés 1UB = quantité d’Ac neutralisant 50% du plasma de référence = 50% d’activité résiduelle corrigé X 100

Modification de Nijmegen Technique classique : manque de spécificité notamment sur les valeurs basses Tamponner le plasma normal ainsi que le mélange contrôle Remplacer le tampon de l’échantillon contrôle par du déficient FVIII immunodéplété pour éviter la chute du pH pendant l’incubation : faux + par inactivation du FVIII:C indépendant des Ac

HEMOPHILIE : Rôle du laboratoire Indispensable pour diagnostic Permet aussi de classer les hémophilies Problèmes de variabilité inter-laboratoire Mais la sévérité est un paramètre clinique Indispensable pour dépistage , titrage et suivi des inhibiteurs Indispensable pour adaptation thérapeutique Cinétique à mise en place d'un traitement, lors d'un changement de traitement, avant chirurgie Parfois nuisible en urgence