Exploration hémostase primaire – actualités 2007 Pr Thomas Lecompte, Service d’Hématologie Biologique, CHU Nancy

Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : moyens de base numération plaquettaire hématocrite TC+A / VIII-Willebrand thrombopénies + morphologie anémies anomalies du f v W

Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII )

Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII ) f v W - antigène cofacteur ristocétine liaison au collagène etc.

Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : facteur von Willebrand Triade classique : TS  Num. plaq. Normale TC+A  (F.VIII ) f v W - antigène cofacteur ristocétine liaison au collagène etc. pièges : Thrombopénie Antigène normal F.VIII  isolément

Exploration de l’hémostase primaire en 2007 : moyens  Numération plaquettaire Facteur von Willebrand Tests globaux : - Temps de Saignement TS - dispositifs in vitro (type PFA-100) Fonctions plaquettaires in vitro

Exploration de l’hémostase primaire en 2005 : moyens de base / 2 Temps de Saignement test global in vivo

PFA 100 (Platelet Function Analyzer) test in vitro Mesure du temps d’occlusion Principe : évaluation de la capacité d’activation des plaquettes en sang total en condition de flux avec contraintes de cisaillement élevées

UTILITE CLINIQUE PFA-100 ? TL fév 2003 question clairement posée compréhension des phénomènes intervenant dans l’évolution clinique et de ceux mis en jeu dans le test qualités métrologiques bonnes, conditions de réalisation du test établies (notamment aspects préanalytiques) performances diagnostiques …

PFA 100 (Platelet Function Analyzer) Dépendant de la NP et de l’hématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand :  GPIb/FvW  GPIIb/IIIa / FvW-collagène

PFA 100 (Platelet Function Analyzer) Dépendant de la NP et de l’hématocrite Sensible aux interactions avec le facteur von Willebrand :  GPIb/FvW  GPIIb/IIIa / FvW-collagène Détecte les atteintes de la voie du thromboxane Peu sensible à celles de la voie de l’ADP

Fonctions plaquettaires in vitro :  Tests d ’agrégation  Cytométrie en flux

Test d ’agrégation plaquettaire Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables d’agréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires % agrégation PRP + agoniste PRP PPP 100 37°C 37°C temps

Cazenave, EFS Alsace, Inserm U311

Test d ’agrégation plaquettaire Les plaquettes, en quantité suffisante, sont capables d’agréger après stimulation par différents agonistes. Détection (le + souvent) par méthode photométrique : éclaircissement du milieu dû aux agrégats plaquettaires Agrégamètres SODEREL MEDICAL, France

Influence du pré-analytique +++ Préparation des plaquettes Qualité du prélèvement Proportion citrate/plasma Traumatismes liés au pipetage et centrifugation Contamination par GR et GB Conservation Température (ambiante) Interface air/liq (bulles) pH-CO2 (alcalinisation du plasma) Déroulement des tests NP (200-300G/L) Propreté des cuves Température (37°C) Agitation Homogénéisation plaquettes/agoniste Délai < 3h après prélèvement

Test d’agrégation plaquettaire Agonistes en 1ère intention : -  max de transmission lumineuse Temps de latence (collagène) Paramètres étudiés : - Allure de la courbe : vagues, réversibilité

Réponse au collagène Réponse avec temps de latence : 30 à 60s Mécanisme : Adhésion de qq plaquettes aux fibres de collagène Sécrétion ADP (grains δ) et synthèse TXA2 Activation des autres plaquettes A forte Cion, AP indépendante du TXA2 (mobilisation Ca2+i)  intérêt de tester 2 concentrations (faible et forte) Explore : - Possibilité d’adhérence au collagène (GPIb/IX/V) - Perturbation des système d’amplification (TXA2, sécrétion)

Réponse à l’acide arachidonique AA métabolisé par la voie des COX pour former le TXA2 TXA2 inhibe l’adénylate synthase plaquettaire : ↓ AMPc et ↑ Ca2+i Activation plaquettaire Explore : - Voie d’amplification liée au TxA2 - Réponse aux inhibiteurs des COX (aspirine et AINS)

Récapitulatif

≠ activateur plaquettaire Ristocétine ≠ activateur plaquettaire Permet la fixation du vWF plasmatique avec GPIb plaquettaire => AGGLUTINATION ,

Effet de l ’aspirine sur l’agrégation plaquettaire Profil normal Répercussions Effet principal Profil aspirine (appareils Soderel)

Exemple de thrombopathie : Thrombasthénie de Glanzmann

Autres tests permettant d’évaluer la fonctionnalité plaquettaire Tests plus spécifiques permettant une exploration « ciblée » Tests de sécrétion : - sécrétion ATP : test luciférine/luciférase - CMF : test à la mépacrine  Expression des Gp plaquettaires (CMF)

Cytométrie en Flux

Plaquette au repos GP IIb/IIIa GP Ib/IX/V Will Will collagène Grains denses Granules a (P-sélectine) Will Will collagène

Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Patient Valeurs de références Etat basal Activation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,5 85,0 37-65 58-112 GPIb CD42b 42,7 25,3 27-49 9-29 Résultats exprimés en nb de sites occupés par l’anticorps x103/plaquette Absence d’anomalie d’expression à l’état basal Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

Activation plaquettaire Plaquette au repos Plaquette activée GP IIb/IIIa GP IIb/IIIa activation GP Ib/IX/V GP Ib/IX/V Grains denses Granules a (P-sélectine) Will Will collagène

Exploration des granules alpha plaquettaires par CMF Trousse Platelet Gp Biocytex – Diagnostica Stago Patient Valeurs de références Etat basal Activation TRAP GPIIbIIIa CD41a 53,5 85,0 37-65 58-112 GPIb CD42b 42,7 25,3 27-49 9-29 GMP140 CD62P 0,8 11,8 <1 >1 Résultats exprimés en nb de sites occupés par l’anticorps x103/plaquette Absence d’anomalie d’expression à l’état basal Bonne réactivité plaquettaire après stimulation par le TRAP

Exploration des granules denses plaquettaires par CMF Test à la mépacrine par CMF : Prélèvement : sang veineux recueilli en présence de citrate. Réalisation d’un PRP. Principe la mépacrine, dérivé de la quinacrine, capturé de façon sélective par les grains denses et non par les grains  et émets une fluorescence verte après excitation à 488 nm. Phase de capture : incubation des plaquettes au repos en présence de mépacrine. Les plaquettes internalisent la mépacrine dans les grains denses, rendant les plaquettes fluorescentes. Phase de sécrétion : les plaquettes activées par la thrombine, relarguent la mépacrine dans le milieu extra-cellulaire ce qui entraîne une diminution de leur fluorescence.

Exploration des granules denses plaquettaires par CMF Étude de la capture/sécrétion de mépacrine par cytométrie en flux (Wall JE, 1995) Capture de mépacrine Sécrétion de mépacrine (stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) x3,60 /2,21 Diminution de la capture et de la sécrétion de mépacrine par les plaquettes

Exploration des granules denses plaquettaires par CMF Mesure de l’expression de CD63 par CMF : Principe: le CD63 est un marqueur de la membrane des granules denses Analyse à l’état basal : mesure de la fluorescence des plaquettes après immunomarquage par un Ac anti-CD63-FITC. Analyse après stimulation plaquettaire par la thrombine : les plaquettes activées par la thrombine sécrètent leur granule  dont leur membrane vient s’accoler à la membrane plasmique, ce qui entraîne une augmentation de l’expression de CD63, soit une augmentation de la fluorescence liée à l’immunomarquage anti-CD63-FITC.

Étude de l’expression membranaire de CD63 par cytométrie en flux (stimulation plaquettaire : thrombine 0,4 UI/mL) X1,99 Diminution de l’expression de CD63 après stimulation plaquettaire

Exploration de la signalisation voie ADP par CMF

Anomalie de réponse à l’ADP ? (appareils Soderel)

Réponse à l’ADP P2Y12

Platelet VASP-FCM Biocytex ADP - P2Y12 + PGE1 AC + AMPc + PKA Connection avec schéma précédent ? Je ne sais pas s ’il est démontré que VASP régule IIb/IIIa… qui a adapté ??? VASP-P Plaquette non activée VASP PP Adapté d’après Horstrup et al. Eur J Biochem 1994, 225 : 21-7

Autres tests permettant d’évaluer la fonctionnalité plaquettaire Nouveaux tests permettant d’évaluer la réponse aux traitements antiplaquettaires Appareils de biologie délocalisée (VerifyNow) Test VASP

Appareil VerifyNow

EN CONCLUSION… 2007 question clairement posée (clinique) TS : de moins en moins utilisé Num plaq + morphologie vWF thrombopathies majeures -SPD coag : W Noramandie /activités procoagulantes plaquettaires thrombopénies constitutionnelles

Exploration hémostase primaire Véronique Latger-Cannard Marie Toussaint-Hacquard Service d’Hématologie Biologique, CHU Nancy