Biologie du système de signalisation cellulaire induit par l’hormone folliculo-stimulante (FSH). UMR 6175 INRA/CNRS/Université de Tours/Haras Nationaux, Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly. Responsable Eric Reiter. INRIA Rocquencourt. Projet Contraintes, Responsable François Fages. Projet SOSSO2, Responsable Frédérique Clément. UMR 6204 CNRS/Université de Nantes. Responsable Véhary Sakanyan.

Rôle physiologique de la FSH. Cellules de Sertoli granulosa D’après http://www.imr-marseille.com/consultation_endocrinologique.htm#

Versatilité des effets exercés par la FSH sur les cellules somatiques des gonades. Mâle SPERMATOGENESE peritubular cells birth spermatogonia spermatocytes spermatids Vie foetale puberté spermatozoa Sertoli cells Basement membrane prolifération différentiation lumen Femelle apoptose différentiation prolifération antrum granulosa follicule follicule follicule à antrum primordial primaire follicule pré-ovulatoire ovocyte OVULATION ATRESIE

De multiples voies de signalisation sont activées par la FSH via un RCPG. kinases b g Mâle Femelle p38 Gas ERK Akt AMPc / PKA PI3-K S6 p70S6K facteurs de transcription NF-kB USF C/EBPb SF1 NF1 CREB Sp1 HIF-1

De multiples voies de signalisation sont activées par la FSH via un RCPG. kinases b g Mâle Femelle p38 Gas ERK Akt AMPc / PKA PI3-K S6 p70S6K facteurs de transcription NF-kB USF C/EBPb SF1 NF1 CREB Sp1 HIF-1

Mécanisme de désensibilisation. R-FSH b g P P P GRK P b-arrestin Gas Désensibilisation AMPc Réponses cellulaires

Signalisation dépendante des b-arrestines. R-FSH b g P P GRK P P b-arrestin Gas/AMPc Signalisation GRK5/6 Désensibilisation GRK2 pERK p70S6K pERK p70S6K Réponses cellulaires

Signalisation dépendante des b-arrestines. R-FSH b g P P P P GRK b-arrestin Gas/AMPc Signalisation GRK5/6 Gs/PKA pERK Désensibilisation GRK2 pERK p70S6K pERK p70S6K Réponses cellulaires

Signalisation dépendante des b-arrestines. R-FSH b g P P GRK P P b-arrestin Gas/AMPc Signalisation GRK5/6 Gs/PKA pERK Désensibilisation GRK2 b-arrestines pERK pERK p70S6K pERK p70S6K Réponses cellulaires

Signalisation dépendante des b-arrestines. R-FSH b g P P P GRK P b-arrestin Gas/AMPc Signalisation GRK5/6 Gs/PKA pERK Désensibilisation GRK2 b-arrestines pERK Gs/PKA pERK + pERK p70S6K b-arrestines pERK pERK p70S6K Réponses cellulaires

Objectif scientifique: mieux conceptualiser le réseau de signalisation induit par la FSH R-FSH Transduction b-arr Gs/PKA ? Codage spatio-temporel ? Cascades de signalisation Rétro-contrôles « Cross-talks » Erk ? ? ? p70S6K « Check-points? » Facteurs de transcription Expression du génome Prolifération/Différenciation Comparaison mâle/femelle Impact sur la gamétogenèse

Mise en place d’un réseau pluridisciplinaire. 2 équipes de biologistes: Mécanisme d’Action des Gonadotropines (MAG), UMR6175, Nouzilly. Follicule Ovocyte et Développement, 1 équipe de protéomique: Véhary Sakanyan, UMR6204 CNRS, Nantes. ASC INRA (2 X 3ans) 2 équipes de modélisation: François Fages, projet Contraintes, INRIA Rocquencourt. Frédérique Clément, projet SOSSO2,

Projet AgroBI 2006-2008: Expériences Connaissances Modèle Mesures Modèles cellulaires : HEK293 R-FSH, cellules de Sertoli, granulosa primaires à différents stades Cinétiques de stimulation FSH inhibitions ciblées (agents pharmaco, siRNA) Expériences Connaissances Modèle Mesures Mécanisme intracellulaires : interface Biocham Intégration dans un modèle multi-échelles de l’ovulation Phosphorylation (puces à anticorps) AMPc,… prolifération, marqueurs de différenciation,...

Outils disponibles: puces à anticorps mesures des niveaux de phosphorylation à haut débit. 2 types de puces: Anti-protéines totales Anti-phospho-protéines Akt Akt1 Akt2 Akt3 ATM Bad Bax Bcl-2 EGFR ERBb2 ERK1 ERK2 FAK GSK-3a GSK-3b JNK ½ MEK 1 MEK 2 NFkB p65 P38a/SAPK P70S6K PI3K p85a PKB Kinase/PDK1 Raf/c-Raf STAT 3 Actin-b Tubulin-a Tubulin-g GAPDH Rb1 S608 Akt S473 Akt T308 ATM S1981 Bad S112 EGFR Y1173 ERBb2 Y1248 ERK1/2 T202/Y204 FAK Y397 GSK-3a S21 GSK-3b S9 JNK ½ T183/Y185 MEK ½ S218/222 NFkB p65 S536 P38a/SAPK T180/Y182 PDK1 S241 PKA ST PTEN S380 Raf S259 Raf S338 STAT 3 Y705 normalisation Plusieurs méthodes de révélation sont en phase d’évaluation et de mise au point. Objectif: 100 à 200 protéines différentes.

Outils disponibles: senseurs fluorescents. Cinétiques de signalisation l’echelle d’une cellule. CFP YFP 434 nm 528 nm FRET EPAC 1 AMPc PDE 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 100 200 300 400 500 Time (Seconds) cAMP (ICUE2 C/Y nRatio) 100 ng/mL 10 ng/mL 1 ng/mL FSH Paramètres mesurables: AMPc PKA PKC DAG PI3K,... Transfection/micro-injection calcium

Outils disponibles: “knock-down” cellulaires par siRNA Transfection transitoire (HEK293) Lentivirus Micro-injection Cellules primaires