Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy Journée des doctorants – 17 déc 04 Confinement moléculaire et organisation de la membrane des cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de fluorescence Laure WAWREZINIECK École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II Spécialité: Biologie des eucaryotes, option Immunologie Sous la direction de: Didier MARGUET, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy Université Aix-Marseille II – CNRS – INSERM Pierre-François LENNE, Institut Fresnel Université Aix-Marseille III – CNRS Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy bourse MENRT

la membrane cellulaire: une structure très complexe! Engelman, Nature, 2005 la membrane cellulaire: une structure très complexe! organisation dynamique: étude de la diffusion différentes méthodes sont possibles: Suivi de particules uniques (SPT) Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Modèles d’organisation compartimentée de la membrane cellulaire Un outil pour étudier la diffusion moléculaire: la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) FCS à rayon variable et lois de diffusion FCS Wawrezinieck et al, SPIE, 2004 Wawrezinieck et al., Biophys J, 2005 Lois de diffusion FCS mesurées dans les cellules vivantes COS-7 et nature du confinement membranaire Lenne et al, EMBO J, 2006 Étude préliminaire de la réorganisation membranaire au cours de l’activation cellulaire

Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation tiré de Singer & Nicolson, 1972

Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi

Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation tiré de Jacobson et al., 1995 animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi mise en contact rapide des différents acteurs d’une réaction  organisation non aléatoire et non uniforme de la membrane

Structure du réseau de microfilaments d’actine Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Structure du réseau de microfilaments d’actine 50 µ m 0,2 µm Image obtenue par microscopie confocale de fluorescence de cellules CEF après marquage par rhodamine-phalloïdine Wakatsuki et al., 2001 Image obtenue par microscopie électronique dans un lamellipode de fibroblaste REF-52 Svitkina et al., 1987

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Le réseau des microfilaments d’actine: un obstacle à la diffusion des protéines transmembranaires récepteur à la transferrine (TfR) équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des protéines TfR dans les mailles du réseau d’actine: taille des mailles: 260 nm temps moyen de confinement: 55 ms Fujiwara et al., 2002

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les protéines ancrées au cytosquelette: un obstacle à la diffusion des phospholipides équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des phospholipides DOPE : taille des mailles: 230 nm temps moyen de confinement: 11 ms Fujiwara et al., 2002

Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” In order to minimize free energies, lipid molecules prefer to organize in structures that best accommodate their dynamic shape

Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”  pas d’observation directe (structures trop petites et trop nombreuses) « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Une définition biochimique: fractions de membranes résistantes à l’extraction par des détergents non-ioniques tels que le Triton X-100 à 4°C (ou le Brij 98 à 37°C) microdomaines enrichis en sphingolipides, cholestérol et certaines protéines hors rafts dans rafts GFP-GPI « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” Vers une définition physique ? utilisation des propriétés de diffusion différentes en présence et en l’absence de microdomaines mesure de la diffusion par des méthodes optiques lipid “platforms” (SM & cholesterol) small (<100nm; ~3000 lipids & ~15 proteins) cover a large surface area of the plasma membrane (between 10 to 80%) stable over seconds move in the plane of the membrane segregate membrane components coalesce under certain conditions « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

La FCS: montage de microscopie de fluorescence Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS: montage de microscopie de fluorescence photodiode à avalanches autocorrélation filtre trou confocal I(t) laser miroir dichroïque volume confocal objectif de microscope échantillon

Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique fluorescence I(t) Intensité de fluctuation de fluorescence temps t Fonction d’autocorrélation:

Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique fluorescence I(t) Intensité de fluctuation de fluorescence =1+ temps t Fonction d’autocorrélation: délai t = 1 + aire relative de recouvrement I(t) copies I(t+t) fluorescence I(t) Intensité de recouvrement temps t

Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique fluorescence I(t) Intensité de fluctuation de fluorescence =1+ temps t Fonction d’autocorrélation: délai t = 1 + aire relative de recouvrement I(t) copies I(t+t) fluorescence I(t) Intensité de aire relative de recouvrement recouvrement temps t délai t

Intensité de fluorescence (kHz) Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas de plusieurs molécules 10 20 30 40 50 60 300 350 Intensité de fluorescence (kHz) temps t (s) 105 délai τ (ms) 1 1.1 1.2 1.3 1.4 101 102 103 104 fonction d’autocorrélation g(2)(τ) temps de diffusion dans le volume confocal

Utilisation de la FCS pour l’étude de la diffusion Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Utilisation de la FCS pour l’étude de la diffusion La FCS traditionnelle: temps de diffusion

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusion τd aire du spot w2

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusion τd aire du spot w2

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusion τd aire du spot w2

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusion τd aire du spot w2 ‘Loi de diffusion FCS’

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusion τd temps de diffusion τd aire du spot w2 aire du spot w2 ‘Loi de diffusion FCS’

La FCS à différentes échelles spatiales Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS à différentes échelles spatiales Le diamètre du spot peut être réglé entre 0,4 et 1,0 µm

Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7 Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7 z lamelle noyau volume confocal 20 selon axe z cellule COS-7 30 μm x y 15 position (µm) 10 5 20 40 60 80 100x103 intensité détectée (cps)

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Analogues lipidiques fluorescents et protéines de fusion utilisées dans les cellules COS-7 glycérophospholipides: FL-PC et FL-PE sphingolipides: FL-SM et FL-GM1 protéines ancrées GPI: GPI-GFP et Thy1-GFP protéines transmembranaires: GFP-TfR et GFP-DPPIV

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7: étude de l’autocorrélogramme 1.20 FL-GM1 GFP-TfR 1.08 1.15 diffusion libre 2D τdiff 1.06 fonction d’autocorrélation 1.10 fonction d’autocorrélation 1.04 1.05 1.02 1.00 1.00 0.001 0.1 10 1000 0.001 0.1 10 1000 délai (ms) délai (ms) L’étude à une seule taille de volume confocal ne permet pas de conclure quant au type de diffusion

Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS-7 Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS-7 100 FL-GM1 GFP-TfR 80 60 temps de diffusion (ms) 40 20 20 40 60 80 100 120 140 160 -20 2 3 2 waist (x10 nm )  Quels types d’organisation de la membrane permettent d’expliquer de telles lois de diffusion?

Simulations: modèles de diffusion Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: modèles de diffusion diffusion libre temps de diffusion aire du spot - w2 réseau domaines isolés obstacles imperméables partage dynamique

Simulations: paramètres Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Modèle des domaines isolés Modèle de réseau w P Pout Din Pin Dmicro Dout 2r r

Simulations: paramètres Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Temps de confinement (τconf ): temps moyen mis par une molécule placée au centre du domaine pour en sortir P r Force de confinement (Sconf ): avec : P : probabilité de sortie d’un domaine r : rayon du domaine : longueur moyenne du pas élémentaire tdiff : temps de diffusion à travers le domaine A : constante

Simulations du réseau: résultats Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats

Simulations du réseau: résultats Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats Grandes tailles de spots confocaux si Xc2>2:

Simulations des domaines isolés: résultats Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats

Simulations des domaines isolés: résultats Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats si Xc2>10: Grandes tailles de spots confocaux a: coefficient de partage t0: indice de confinement

obstacles imperméables Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: résumé des résultats réseau domaines isolés obstacles imperméables diffusion libre obstacles imperméables t0 = 0 diffusion libre t0 = 0 Aires accessibles temps de diffusion Aire du spot confocal domaines isolés t0 > 0 réseau t0 < 0

Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides FL-PC: glycérophospholipide GFP-GPI: protéine ancrée GPI FL-GM1: sphingolipide

Modification enzymatique de la membrane Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Modification enzymatique de la membrane cholestérol oxydase sphingomyélinase sphingomyéline

Modification enzymatique de la membrane Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Modification enzymatique de la membrane cholestérol cholesténone cholestérol oxydase (COase) sphingomyéline sphingomyélinase (SMase) + céramide

Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques 50 40 30 20 10 temps de diffusion (ms) 120x10 3 80 waist 2 (nm ) FL-GM1 + COase 1U/mL + SMase 0.1 U/mL sans traitement

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques mais pas dans les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques

Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques Cyto D Les glycérophospholipides, sphingolipides et protéines ancrées GFP ne sont pas sensibles au confinement par le réseau d’actine

Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control

Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control

Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM)

Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM) + cytochalasine D (10 μM)

modif radeaux lipidiques Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques modif actine + modif radeaux lipidiques

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire des protéines transmembranaires dans les radeaux lipidiques et dans les mailles du réseau d’actine Cyto D Cyto D

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou dans les mailles du réseau d’actine caractéristiques des mailles du réseau d’actine: caractéristiques des domaines isolés: taille des mailles: 2r = 240 ± 60 nm tconf de l’ordre de plusieurs dizaines ou centaines de ms structure dépendante de la température taille des domaines: r < 60 nm tconf de l’ordre de plusieurs dizaines de ms structures indépendantes de la température

Application à l’étude de l’activation des lymphocytes T Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Application à l’étude de l’activation des lymphocytes T Principe: mesures sur cellules Jurkat, dont on maîtrise l’activation par ajout dans le milieu de culture d’un anticorps anti-CD3 humain Complexe TCR/CD3

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation

Temps de diffusion et lois de diffusion FCS au cours de l’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Temps de diffusion et lois de diffusion FCS au cours de l’activation Ajout de l’anticorps 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment expliquer la loi de diffusion FCS mesurée au pic d’activation ? loi de diffusion obtenue pour un confinement total dans un domaine de taille finie

Proposition de modèle… Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Proposition de modèle… activation

Conclusion et perspectives… Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Conclusion et perspectives… étude qualitative: distinction entre deux types de confinement étude quantitative: mesure du temps de confinement et estimation de la taille 1ère mise en évidence de l’existence des radeaux lipidiques dans les membranes de cellules vivantes au repos

Conclusion et perspectives… Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Conclusion et perspectives… travaux utilisant la technique développée dans cette thèse Fas/Fas ligand  F. Conchonaud et L.W. travail en collaboration avec l’équipe de A.-O. Hueber (Cahuzac et al, Blood, 2005) z dans cellules T  travail poursuivi par Y. Hamon Ras/EGFR  F. Conchonaud nanotrous  J. Wenger (Wenger et al, to be published) AkT  R. Lasserre, F. Conchonaud et Y. Hamon NCam  IBDM

Un grand merci à: Nadia Djaker PhD Federico Belloni PhD PACA/Zeiss David Gachet PhD Patrick Ferrand Pierre-François Lenne Serge Monneret Jérôme Wenger Hervé Rigneault Federico Belloni PhD PACA/Zeiss Fabien Conchonaud PhD Laure Wawrezinieck PhD Annie Boned Annemarie Lellouch Arnauld Sergé Didier Marguet Un grand merci à: H. Qasmi et N. Bertaux pour les simulations N. Sandeau pour les calculs de volumes confocaux F. Conchonaud pour toutes les préparations de cellules et les mesures de FRAP O. Würtz et A. Boned pour la biochimie O. Hawchar et Y. Hamon et H-T He pour les mesures sur Jurkat et P-F Lenne, H. Rigneault et D. Marguet pour leur soutien sans faille

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Quelques tests supplémentaires pour vérifier nos résultats expérimentaux mesures de FRAP: mesures de photoblanchiment: mesure de la fraction mobile: >95% des analogues lipidiques fluorescents sont mobiles >75% des protéines marquées par la GFP sont mobiles choix de la puissance d’excitation : compromis puissance suffisante pour avoir un bon rapport signal sur bruit puissance suffisamment faible pour pouvoir négliger le photoblanchiment  les lois de diffusion FCS mesurées décrivent correctement le comportement des molécules marquées

Structure et rôle du complexe TCR/CD3-z Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Structure et rôle du complexe TCR/CD3-z

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protocole d’étude de la réorganisation membranaire au cours de l’activation Protocole: Placement du volume confocal sur la membrane Addition antigène anti-CD3 humain 30 s après ajout: début des mesures 10 min découpés en runs de 5 s Regroupement des mesures en tranches de 1 min

Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation/au pic d’activation

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation mesures prises à t<0 (plein) et t ∈ [3;4] min (creux)

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation mesures prises à t<0 (plein) et t ∈ [3;4] min (creux)

Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation mesures prises à t<0 (plein) et t ∈ [3;4] min (creux)