LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE CHEZ LES MICROORGANISMES Ibtissem GRISSA Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM

PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Résultats Discussion Perspectives PLAN 26/03/2017 Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes

La découverte des CRISPRs (1) Introduction La découverte des CRISPRs (1) spacers DR dégénéré Leader DR TTAGGGTTACGTCCCCCCCGATTCTTGTGACCCTCTTTTTATCACTATGACTAACGTATTGATTTTTATGCTACTCAGGTATTTCACTAAAAAAAGGGTTTTTACGCATTTTGCGCCATTGCTCATTGATAAACATCGGGTTATCCGTATTATCTTACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAGGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAAGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAGTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA Yersinia pestis CO92 (NC_003143_2 ) 1ère observation : Escherichia coli (Ishino 1987) succession de séquences répétées de 29pb espacées de séquences uniques de 32-33pb. 2 locus séparés de 24 kb (14 et 7 répétitions)

La découverte des CRISPRs (2) Introduction La découverte des CRISPRs (2) 1991 : découverte d’un CRISPR dans le complexe Mycobacterium tuberculosis Structure présente chez tous les membres du complexe M. tuberculosis Marqueur génétique assez polymorphe pour différencier les souches 1996 : Le spoligotypage pour le typage épidémiologique de M. tuberculosis (Membrane d’oligonuclétides composée de 43 spacers) Obeservations chez les archées : 2 Haloferax volcanii et H. mediterranei (Mojica et col. 1993, 1995) Sulfolobus (She 1994)

L’acronyme CRISPR E. coli H. mediterranei et H. volcanii Introduction L’acronyme CRISPR TREP Tandem Repeat SRSR Short Regularly Spaced Repeats DVR Direct Variable Repeat LCTR Long Cluster of Tandem Repeat SPIDR Spacers Interspaced Direct Repeats CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Jansen 2002 E. coli DR : 29bp, spacer : 32-33pb CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC H. mediterranei et H. volcanii DR : 30bp, spacer : 33-39pb GTTACAGACGAACCCTAGTTGGGTTGAAGC M. tuberculosis DR : 36pb spacer : 35-41pb GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC

Un groupe de gènes associés Introduction Un groupe de gènes associés Le système CASS : CRISPR + cas gènes cas spacers DR dégénéré Leader DR Jansen 2002 cas1 : réparation de l’ADN cas2 : transposase cas3 : hélicase cas4 : recB exonuclease Makarova 2002 20 gènes impliqués dans la réparation de l’ADN Etude phylogénétique des gènes cas Présence du même DR chez des espèces éloignées Transfert horizontal

Transcription du locus CRISPR Introduction Transcription du locus CRISPR Tang et col. PNAS 2002 Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archeon Archaeoglobus fulgidus.

Introduction Origine des spacers 2005 : origine des spacers et suggestions sur le rôle du CRISPR Mojica 2005 Pourcel 2005 Bolotin 2005 67 procaryotes Yersinia pestis Y. pseudotuberculosis Streptococcus pyogenes Streptococcus thermophilus S. vestibularis Acquisition du spacer à partir d’éléments génétiques préexistants d’origine extrachromosomique (phages, plasmides) ou chromosomique Génomes analysés Spacers analysés Spacers reconnus phages plasmides chromosome 67 4500 88 (2%) 47 (54%) 10 (11%) 31 (35%) (Mojica 2005) Corrélation avec la résistance aux phages Hypothèse : Le CRISPR est un système immunitaire chez les procaryotes utilisant l’interférence ARN

Un système de résistance par interférence ARN Introduction Un système de résistance par interférence ARN Modèle d’action du CRISPR Leader sp4 sp3 DR sp2 sp1 DR’ Transcription ARN Cas Cas sRNA Protéines Cas Cas sRNA phage ADN invasif Dégradation du phage

Evolution de la structure CRISPR Introduction Evolution de la structure CRISPR Acquisition polarisée adjacente à la séquence leader Perte interstitielle de spacers Les spacers communs renseignent sur un ancêtre commun ADN invasif + Cas Cas + Leader sp3 DR sp2 sp1 DR’ = Leader sp4 sp3 DR sp2 sp1 DR’ Le polymorphisme des spacers est un indicateur phylogénétique

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Introduction Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome Outils informatiques pour faciliter l’exploration, la compréhension et l’utilisation des CRISPRs

PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Résultats Discussion 26/03/2017 Résultats Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes

Outils informatiques créés Introduction Outils informatiques créés Données Gold Oct. 2005 315 génomes complets 804 procaryotes en cours Analyse systématique de tous les CRISPRs des génomes séquencés Utilisation du CRISPR pour la phylogénie intra-espèce Créer une base de données Analyser les séquences flanquantes Stocker les DR Stocker les spacers (tronçons de virus) Effectuer des BLAST Analyse de la microévolution Comparaison des CRISPRs Identifier les spacers Construire un catalogue par espèce CRISPRdb CRISPRcompar Identifier les CRISPRs

Les programmes utilisés Résultats Patscan p1=24...47 15...70 p1 Programmes non spécifiques aux CRISPRs Besoin de traitement manuel supplémentaire REPuter Repeat size Start position TRF Consensus pattern (60 bp): GTGTTCCCCGCGCATCGCGGGGGTTGAAGGGTCAGGTCTGCATCAACGATCGCCCACTCC Besoin d’automatisation Définition des limites du DR

Création de CRISPRFinder Résultats CRISPRFinder A a c b d Utilisation de Vmatch (Reputer) -Liste des répétitions maximales ayant une taille bien définie, séparées par des séquences de taille prédéfinie

CRISPRFinder : difficultés (1) Résultats ! Y. pestis C092 Positions : 1773655-1773862 Les bornes du DR: DR consensus 29 pb La taille des spacers Clostridium botulinum A3 Positions : 131045- 131754 Entre 21 et 37 pb 30 pb

CRISPRFinder : difficultés (2) Résultats Shewanella sp. ANA-3 (CRISPR_2) (4626121) 1 AGGTTTTGCTGCCTTTTCGGCGGGTAT C TCAAAGTCAACTTGTAAATGACGATTTTCACG 32 ** ** * * ** 2 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCA C AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAT 32 3 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCA C GATGAAGCAGACCACCTCGATTACCCCACGCT 32 4 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCA C ACTATTTATCAAGACCTTCTTTAAAATCAAAC 32 5 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCA C AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAC 32 6 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCA C (4626448) Yersinia pestis KIM (CRISPR_4) 1 TTATTGGGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC GTTATACCCCGCGCAGGGAGTGAAGCGTTGAC 32 2 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC TTAAGTTCTTTTTGTCAGCATCTTTAATAAA T 3 CTGAAATACAAATAAAATAAATCGTCGAACAT 4 (2875721) (2875928) ** ** Le DR dégénéré Sulfolobus tokodaii str. 7 (CRISPR_2) 7 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGATTGATCACAATGAGAAGACTGTAAAGCTGATAAAC 38 8 TGTTGAGGCATAAATTAATCTATCCTTAATGAAAAAT 37 9 TTCTTCCTCAGCCTCCATTTTGTTTATGATTTGTAGTGCC 40 10 TTCAATAATCTCTATCTTTCCAAAATCTGTAAATGAAGAC 109 AAAGCACAGTCAATAACGTTATCTGGTATCATATTATCAAA 41 110 CTTTCT CCTTCCCTCTGATCTCTCGCTGAATTGAAAAGA 39 111 GTAAGTATTGATGCTAACATTGACTTCGCTGTCCCAGGGGC 112 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAGG AAGTATAATAACGATAGTACTAAAATTAATTGATCC 36 113 GATGATTCTCAAAAGGAATTGATAA * * *** (32702) (39896)

CRISPRFinder : difficultés (3) Résultats Les petits CRISPRs Aquifex aeolicus VF5 NC_000818_6, positions : 988518-988611 Alignement des leader

Les grandes étapes de CRISPRFinder Résultats Sequence(s) Localisations possibles 25bp - 60bp DR DR 23bp - 55bp Répétition maximale ? Identification des DR candidats CRISPRs confirmés CRISPRs putatifs DR’ DR 23bp - 55bp [0.6DR - 2.5DR] [ , ] Vérification de la structure Vérification des DR aux extrémités Elimination des Répétitions en tandem

Création de la base CRISPRdb Résultats Filtres ajoutés pour la base Télécharger les génomes complets sur le site NCBI ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria Appliquer CRISPRFinder Filtres sur les CRISPRs putatifs Blast des DR et vérification de la terminaison Vérification de la taille des DR et spacers Vérification manuelle Validation

Bilan CRISPRdb Résultats Mise à jour du 05/06/2008 Des CRISPRs de un à presque 300 motifs de long (moyenne : 23) (22 pour les bactéries et 27 pour les archées) Une espèce peut posséder jusqu’à 20 CRISPRs (Methanocaldococcus jannaschii) 2 ou plusieurs CRISPRs de DR identiques ou différents Les CRISPRs constituent presque 1% du génome qui les portent (1,1% chez Sulfolobus tokodaii) Les souches d’une même espèce ne partagent pas toujours les mêmes CRISPRs

PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 26/03/2017 Résultats Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes

Le CRISPR pour la phylogénie intra-espèce Résultats Mécanisme d’évolution par délétion ou par insertion polarisée Analyse de multiples allèles de différentes souches pour un locus CRISPR donné Lorsque l’espèce contient un ou plusieurs CRISPRs Lorsque le CRISPR présente un polymorphisme intra-espèce important Espèces jeunes (Y. pestis, M. tuberculosis) ou complexes clonaux (Pseudomonas aeruginosa) contrairement aux espèces plus anciennes (Y. pseudotuberculosis, M. canetti)

Investigations (1) Identification d’un (plusieurs) CRISPRs Résultats Identification d’un (plusieurs) CRISPRs Consultation de la base CRISPRdb Utilisation de CRISPRFinder Quantifier le polymorphisme du CRISPR Utilisation de CRISPRcomparison MyCRISPRdb

Investigations (3) Choisir les amorces PCR : 20-30pb à 40 pb du CRISPR Résultats Choisir les amorces PCR : 20-30pb à 40 pb du CRISPR Flankalign CRISPRcomparison sp4 Leader DR’ DR sp2 sp3 sp1 F1 R1 R2 Manipulations techniques sur une collection représentative d’une espèce (amplification PCR et séquençage)

Analyse des données (1) Constituer un catalogue de spacers 26/03/2017 Résultats Constituer un catalogue de spacers http://crispr.u-psud.fr/crispr/Dict/Dict.php

Analyse des données (2) Fichiers de sortie Résultats TableCodedAlleles 26/03/2017 Résultats Fichiers de sortie TableCodedAlleles Organisation des locus CRISPR dans six souches Y. pestis Fichier binaire

PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Résultats Discussion 26/03/2017 Discussion Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorations des outils Les métagénomes Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes

Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder Discussion CRT Rapidité Trouver le DR dégénéré Définition du DR consensus PILER-CR Rapidité Peu de faux positifs Mais DR dégénéré DR consensus Petits CRISPRs Faux positifs Chevauchement de CRISPRs Plusieurs propositions Petits CRISPRs

Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder Discussion Streptococcus sanguinis SK36, PILER-CR CRT NON Oui, mais

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Organisation du CRISPR (1) Discussion DR Le DR : DR Taille : 23-47pb, terminaison particulière : (C/G)AA(A)(G/C) Espèce taille DR Bacteroides fragilis 47 GCTGTTTCCAATGGTTCAAAGATACTAATTTGAAAGCAAATCACAAC Streptococcus pyogenes 36 GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC Mycobacterium tuberculosis GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC Escherichia coli 29 CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC Yersinia pestis 28 GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA Pyrobaculum aerophilum 25 CCAGAAATCAAAAGATAGTTGAAAC Thermotoga petrophila 30 GTTTCAATAGTTCCTTAGAGGTATGGAAAC Structure secondaire (kunin 2008) Clustering des DR (12 groupes) (kunin 2008, Horvath 2008) Diversité d’un CRISPR à l’autre (533 DR distincts pour 873 CRISPRs) Conservation presque parfaite au sein d’un même CRISPR

Organisation du CRISPR (1) Discussion Thermoproteus neutrophilus DR Verminephrobacter eiseniae : 294 DRs exactement identiques Un système de maintenance de l’intégrité du DR?

Organisation du CRISPR (2) Discussion DR Les spacers : Taille constante ou variable Signature particulière sur le génome d’origine (proto-spacer) (Deveau 2008) Identification de virus à partir des spacers (Andersson, science 2008) Le même spacer sur deux CRISPRs différents du même génome ou chez des souches voisines Duplication ou acquisition indépendante d’un spacer sur le même CRISPR (Horvath 2008) 417 spacers présents en deux copies parmi 21497 (< 2%) 89 souches parmi 712 (~13%) Methanothermobacter thermautotrophicusus

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Démonstration du rôle du CRISPR Discussion Implication dans l’acquisition d’une résistance contre les phages (Barrangou et col., Science 2007), (Horvath 2008), (Devau 2008) Autre rôle? Régulation de certains gènes? Modèle interférence ARN chez les procaryotes (Makarova 2006)

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Confirmation de l’acquisition polarisée Discussion Acquisition polarisée : (lillestol 2006), (Barrangou 2007), (Horvath 2008), (Tyson& Banfield 2008), (Andersson 2008) Leader Le CRISPR NC_007503_3 de Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. Le DR jaune + le leader chez NC_007503_3 et NC_007503_4

Acquisition de nouveaux motifs Discussion Comment le dernier motif est-il ajouté? ADN invasif Leader DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ DR3 copie sp4 DR3 copie Leader DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ DR3 copie sp4 Leader DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ Le DR adjacent au leader est le dernier DR acquis ou le premier DR acquis? sp4 Leader sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ Leader DR3 sp4 DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Le CRISPR comme marqueur phylogénétique Discussion Avantages: Facilité technique (PCR ou spoligotypage) Rapidité Importation et échangeabilité inter-laboratoires Limites: 60% des bactéries n’ont pas de CRISPR Acquisition indépendante du même spacer CRISPR non polymorphes ou absents (Lactobacillus casei ) CRISPR très polymorphe (Y. pseudotuberculosis, M. canettii) Bon outil de différenciation de souches + outil complémentaire pour étudier la micro-évolution

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Transfert horizontal du CRISPR Discussion Transport à travers les plasmides (Godde 2007) Même leader et même DR Legionella pneumophila Lens Le même DR chez des espèces éloignées %GC différent du reste du génome (Horvath 2008)

Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Discussion Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome

Création d’un nouveau CRISPR Discussion Les essaimages de CRISPRs Un seul groupe de gènes associés Le même DR (quelques déviations parfois) Spacers différents Hypothèse : structure minimale transposée formée d’un leader et un DR DR DR

PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Résultats Discussion 26/03/2017 Perspectives Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorations des outils Les métagénomes

Perspectives (1) Investigations des petits CRISPRs Confirmation des CRISPRs putatifs (blast DR, …) Vérifications manuelles? Recherche des gènes cas Recherche de proto spacer Epidémiologie, phylogénie (Projets en cours) Exploitation des données de métagénomes Explorer des génomes de l’environnement (communautés multi-espèces) Nature des CRISPRs, statistiques, transfert horizontal… Exploration des phages pour chercher les proto-spacer et identifier leurs sites de reconnaissance Stockage des DR et des spacers avec possibilité de BLAST

Perspectives (2) Perspectives Diversité des DR : 24-43 pb Nombre de motifs : jusqu’à plus de 250 motifs

LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE CHEZ LES MICROORGANISMES Ibtissem GRISSA Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM