Application à la biologie La fluorescence Application à la biologie

La fluorescence Principe de la fluorescence Microscopie à épifluorescence

Généralités Les fluorophores sont avant tout des chromophores Les chromophores sont des constituants moléculaires qui absorbent la lumière hc/λ1, Ce sont en général des composés aromatiques. Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à une longueur d’onde différente hc/λ2 4n+2 e-

Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ? (lumière d'excitation) La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité. La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de 10-9 à 10-7 s GFP : τ = 2,1 ns e- Perte d’énergie Émission de fluorescence, de plus faible énergie (plus grande longueur d’onde) Photon (lumière d'excitation)

Diagramme de Jablonski (simplifié) T1 ABS FL Relax th ENERGIE Photoblanchiement Phosp S0 Eexc = Eem + chaleur (Eexc > Eem) E = (hc)/ l  λexc < λem

Les molécules fluorescentes utiles en biologie Des protéines De petites molécules aromatiques Des nanocristaux de semiconducteurs

GFP Absorption Rendement Q

Représentation d’une protéine fluorescente tétramérique (asFP595) Chromophore (GFP) : -S-Y-G- Maturation post-traductionnelle du fluorophore de la GFP

Les marquages en immunofluorescence fluorochrome Anticorps secondaire Anticorps primaire Antigène Echantillon Coupe semi-fine

Représentation d’un fluorophore inorganique (Alexa 568)

Exemple de quadruple marquage DAPI ex em Alexa 488 TRITC Cy5 400 500 600 700 nm UV IR

Photoblanchiment (photobleaching, fading) Alexa 488 Oregon Green 514 Fluorescence (% valeur initiale) BODIPY Oregon Green 488 Fluorescein Temps (secondes)

Spectre continu

Trajet optique Microscope droit Observation en lumière transmise Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de la GFP Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de l’Alexa 568.

Exemple d’image en épifluorescence (dendrites de neurone P-GFP)

C’est tout et c’est déjà pas mal !!!!

Principaux fluorochromes utilisés en microscopie en épifluorescence et confocale - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors - ADN : iodure de propidium, YOYO, Syto16, chromomycine A3, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3 - mitochondie : sensible au potentiel membranaire Rhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible) - membranes : FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de propidium,… morphologie, avec DIC - réticulum endoplasmique: (non spécifique) DiOC6(5), GFP-taggée - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour végétaux) - dépendance envers le pH : carboxy-SNARF-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon - divers : Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines Autofluorescentes

Quelques documents Wikipedia http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence Live Cell Imaging (Goldman&Spector, Cell Press) Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur, De Boeck) Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke, Taatjes, Douglas, Humanan Press) Fluorescence microscopy (Rost , Fre, Cambridge University Press)

GFP photoactivable, photoconversion Quantum dots Bonus GFP photoactivable, photoconversion Quantum dots

Les paramètres caractéristiques d’un fluorophore : http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence Spectre d’absorption : capacité à absorber la lumière (chromophore) caractérisé par son maximum Spectre d’émission : capacité à émettre de la lumière après excitation caractérisé par son maximum Décalage de Stokes : mesure l’écartement des deux spectres précédents, en général on préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift » Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole de fluorophore (excitabilité) (λ donné) Rendement quantique Φ : probabilité qu’un fluorophore excité émette un photon (efficacité de fluorescence) 0<Φ<1 Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière d’excitation donnée. B = ε x Φ Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore Durée de vie à l’état excité (pour certaines applications)

Photo-activation exemple : PA-GFP Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656

Quantum dot: particule fluorescente non aromatique !!! Core nanocrystals with size between 3-8 nm (CdSe, CdTe, CdS, ZnSe) anorganic shell (ZnS, CdS) organic shell (silica/siloxane, phospholipides, proteins) 10 - 15 nm

Ordre de grandeur - Q-dot

Propriétés Forte brillance Résistance au photoblanchiement Brillance = ε.ΦF eGFP 33 000 Q Dot 1 000 000 Forte brillance Résistance au photoblanchiement Clignotement Large gamme de spectre accessible en excitant dans le domaine UV

Exemple d’application : suivi de molécules uniques