Polymorphismes génétiques des anti-cancéreux T Berdous INSERM U716 Pr F Calvo Direction : S Mourah

Le bon traitement, à la bonne personne PHARMACOGENETIQUE Variabilité interindividuelle de la réponse à un médicament Objectifs => Améliorer la maîtrise de la variabilité interindividuelle Individualiser le traitement médicamenteux : choix de la molécule mais aussi posologie et rythme d’administration Le bon traitement, à la bonne personne et, au bon moment

Polymorphismes génétiques Définition: Modification de séquence, stable, observée chez plus d’1% de la population -Répétitions en tandem : microsatellites/minisatellite -La plus simple se situe au niveau d'un nucléotide : Single Nucleotide Polymorphism ou SNP Le génome humain : 107 de SNP / 3 milliards pb contribuant à la diversité de l'espèce humaine Variations nucléotidiques & conséquences : séquence acide aminé l'expression in fine l'activité Certains polymorphismes sont non fonctionnels ou silencieux, conservation structure et/ou fonction.

Conséquences cliniques des différents phénotypes métaboliques pour un médicament à index thérapeutique étroit : anticancéreux

Anticancéreux La classification des agents anticancéreux se fait suivant leur mécanisme d'action sur le cycle cellulaire et leur appartenance à des familles chimiques. Médicaments altérant l'ADN : - agents intercalants = daunorubicine , anthracyclines (la pluplart sont des antibiotiques) - inhibiteurs de la topoisomérase I et II = irinotécan, étoposide Inhibiteurs enzymatiques : - de la dihydrofolate réductase = méthotréxate Antimétabolites : - 5-fluoro-uracile Cytokines : - interféron alpha Altération du fuseau mitotique :

Métabolisme et transport des Xénobiotiques

Objectif Mise au point et validation d’une méthode de détection des polymorphismes des gènes MDR1 et UGT1A1, basée sur la technologie de PCR à sonde d’hybridation : ► Polymorphismes des exons 26 et 21du gène MDR1 : transport des Anthracyclines et de l’Aracytine ► Polymorphismes de la TATA Box du gène UGT1A1 : toxicité à l’Irinotécan ► Association des SNP avec l’expression génique

MDR1 - P-gp - gp170 P-gp Function P-gp, the most prominent drug transporter, is a member of the ATP-binding cassette transporter family. P-gp was first identified on cancer cells, where it was shown to limit the ability of chemotherapeutics to enter the tumor. P-gp is the gene product of the multidrug resistance gene 1 (MDR1). La P-glycoprotéine (P-gp) : protéine transmembranaire impliquée dans l’efflux de peptides endogènes et exogènes, sur-expression associée à la résistance tumorale à des agents anticancéreux (multidrug resistance ou MDR). lié à la surexpression du gène MDR1 (Multi Drug Resistance) et à la surproduction d ’un transporteur ATPasique membranaire, la glycoprotéine P La glycoprotéine P est une pompe membranaire localisée dans les tissus émonctoires et qui permet l ’élimination des xénobiotiques L a résistance MDR est caractérisée par - une diminution des concentrations intracellulaires des cytotoxiques - une résistance croisée entre de nombreux cytotoxiques - une réversibilité par action compétitive d ’autres médicaments : vérapamil transporteur le mieux caractérisé de la famille des ATP Binding Casette protéines responsable de l’efflux cellulaire d’anticancéreux (Anthracyclines…) surexprimé (ARN et protéine) dans les cellules cancéreuses

► 28 polymorphismes décrits (1236, 2677, 3435) ► Le SNP 3435C>T sur l’exon 26 définit 3 génotypes : CC, CT et TT ► Fonctionnalité de la Pgp dans les cellules hématopoïétiques moins élevée avec le génotype TT par rapport au CC (Hoffmeyer 2000) mais l’inverse est trouvé par d’autres (Kim 2002) ►La fréquence de la mutation C>T varie selon les races : génotype CC plus fréquent chez les africains et les afro-américains (83 et 61%) par rapport aux caucasiens (26%) et aux japonais ou chinois (34%) (Schaeffeler 2001); 83-84% versus 48% et 53% (Ameway 2001)

Polymorphisme du gène UGT1A1 en réponse à l’irinotécan Uridine diphosphate Glucuronyl Transférase : enzyme membranaire Enzyme de phase II, catalyse la glucuronoconjugaison. ► polymorphisme de répétition dans la TATA box du promoteur ( délétion ou insertion de séquence TA) plusieurs allèles (TA)5, (TA)7, (TA)8 (phénotype sauvage (TA)6). ►TA7 est associée à l’état homozygote, à la maladie de Gilbert (Kadakol 2000). ► déficit en UGT1A1 est à l’origine d’une toxicité sévère (diarrhée, leucopénie) dans le traitement de certains cancers par l’irinotécan structure du gène UGT1A1

Patients & Méthodes - 9 patients atteints de Leucémie aigue myéloblastique et 20 donneurs sains ont été inclus - les PBMC ont été isolées (Ficoll) - les ADN et ARN des PBMC ont été extraits sur colonnes Qiagen - détection des SNP 3435 C>T (exon 26) et 2677 C>A (exon 21) du gène MDR1 et de UGT1A1 en utilisant la technologie des sondes à hybridation (Roche) - quantification des transcrits MDR1 par RT-PCR quantitative en utilisant la technologie des sondes à hydrolyse (TaqMan™)

Méthodes Technologie SybrGreen Sondes à Hybridation Fluorescéine LCRed 640

Résultats - MDR1 PCR point final PCR en SybrGreen Mut Mut 3435 neg 150 pb Mut Mut 2677 - 3435 - PCR point final PCR en SybrGreen 2677 3435

Polymorphisme – MDR1 / 3435 C>T Tm nt 3435 : Wt = 56°C Mut = 64°C PCR en Sonde à hybridation

Polymorphisme –MDR1 / C3435T Répartition des génotypages MDR1 (n=9) CC CT TT (2/9) (5/9) (2/9)

Polymorphisme – MDR1 / C2677A Homozygote sauvage 2677 Pas de mutation Tm 59°C

Quantification des transcrits MDR1 et SNP Identification échantillon Génotype Tanscrits MDR1 (copies/106 copies b2m) C42 3435CT / Hétérozygote 2115 C77 250 C112 200 C114 300 C100 11 C73 3435CC / Homozygote sauvage 1536 C16 4 C71 3435TT / Homozygote muté 643 C121 39 ► 2 donneurs sains homozygotes sauvages ► Moyenne d’expression des transcrits MDR1 : 21.3 et 566 copies de MDR1/106 copies b2m respectivement dans les 2 groupes (20 donneurs sains et 9 LAM). ► Association C3435T : Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5)

Résultats – UGT1A1 sonde TA7 Répartition des génotypages UGT1A1 (n=6) Tm 40°C 46°C 40°C Répartition des génotypages UGT1A1 (n=6) TA6/TA7 TA6/TA6 (4/6) (2/6) Selon la méthodologie décrite par Von Ahsen en 2000

Discussion Identification fiable et reproductible des différents polymorphismes MDR1 et UGT1A1 étudiés MDR1 C3435T : Détection de différents profils dans les LAM (hétérozygotes, homozygote muté/sauvage), Donneurs sains homozygotes sauvages 3435CC C2677A : un seul génotype : homozygote sauvage Ces fréquences sont en accord avec celles rapportées par d’autres équipes. La mutation C2677A est décrite comme rare (Hoffmeyer et al 2003)

Discussion Association SNP et expression de MDR1 : - Illmer et al 2002, association phénotype-génotype des polymorphismes MDR1 (n = 405 patients) : C3435T, C2677A & C1236T - Association C3435T : Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5)

UGT1A1 Sonde TA7, caractérisation de 2 profils génotypiques : - homozygote sauvage TA6/TA6 - hétérozygote muté TA6/TA7 - les autres génotypes non mis en évidence groupe restreint Le génotypage de ces polymorphismes est réalisable avec les sondes TA6, TA8 (validation des résultats). Optimisation de la méthode décrite par Von Ahsen et al Détection des différents génotypes en utilisant une seule sonde TA7

Conclusion & Perspectives ► Mise au point et validation de la détection des SNP C3435T, C2677A (MDR1) et polymorphismes UGT1A1 par sonde à hybridation ► Méthode reproductible et fiable, spécifique et sensible (picogrammes d’ADN) ► Evaluer les conséquences cliniques et thérapeutiques de ces SNP ► Association phénotype-génotype Mise à disposition du médecin de tests de dépistage de polymorphismes génétiques, réalisables en routine, permettant de prédire l’efficacité ou la toxicité d’un traitement pour un individu donné.

Sonde Génotype Tm par Tm PCR Thermodynamie UGT1A1 TA5 35,4°C 36,3°C TA6 39,9°C 39°C TA7 46,2°C 46,4°C TA8 42,2°C 41,3°C Nos résultats sont en accord avec ceux décrits par Von Ahsen en 2000

Mécanismes moléculaires à l’origine d’une anomalie du métabolisme Le but de la pharmacogénétique sera d'optimiser les traitements médicamenteux (réduire les effets indésirables, accroître l'activité), en se basant sur les déterminants génétiques d'activité et de tolérance d'un médicament (génotype), pour chaque patient elle a pour but ultime le développement de tests simples permettant d’identifier les individus à risque de telles anomalies de réponse.