BIOLOGIE MOLÉCULAIRE (COURS DE 1ÈRE ANNÉE)

PLAN DU COURS INTRODUCTION GÉNÉRALE - Définition : biologie moléculaire STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES DES ACIDES NUCLÉIQUES - Structure : ADN et ARN - Propriétés biologiques et chimiques du DNA ORGANISATION DES GÈNES ET RÉPLICATION DU DNA - Comparaison cellules procaryotes et eucaryotes FLUX DE L ’INFORMATION GÉNÉTIQUE : MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE L ’EXPRESSION DES GÈNES - TRANSCRIPTION DU DNA OU BIOSYNTHÈSE DU mRNA - TRADUCTION OU BIOSYNTHÉSE DES PROTÉINES EXPLORATION ET MANIPULATION DES GÈNES : BIOTECHNOLOGIE DE L ’ADN RECOMBINANT - Clonage des gènes - Transgénèse NOTIONS SUR LA PATHOLOGIE DU DNA - Mutation - notion de thérapie génique (gène médicament)

INTRODUCTION GÉNÉRALE Définition de la biologie moléculaire = étude de la vie à l ’échelon moléculaire : domaine très vaste (trop?) de la biologie. = commande, mise en œuvre et régulation des fonctions moléculaires (cellule, tissu, organisme) Biologie du gène = biochimie génomique (Réplication de l ’ADN) division S1 Biosynthèse des protéines = traduction S2 Survit S3 Expression de gènes spécifiques S4 différenciation Mort cellulaire physiologique (apoptose) Fragmentation de l ’ADN

Cellules germinales = gamètes ADN = molécule universelle de l ’hérédité chromosomique (excepté certains virus) n=23 n=23 méiose Cellules haploides Cellules germinales = gamètes mâle femelle fécondation 2n=46 Cellule diploide Transmission de l ’ADN = caractères génétiques d ’un individu Transmission d ’une altération de l ’ADN = pathologies moléculaires (mucoviscidose, drépanocytose, myopathies …)

Régulation : activation ou répression Flux de l ’information génétique ARN t Effets biologiques Gènes = ADN ARN m protéines -développement -différenciation -métabolisme ... transcription traduction réplication Régulation : activation ou répression ADN et ARN = commande la vie cellulaire Protéines = effecteurs Altération de l ’ADN ou ARN protéine défectueuse situation pathologique (ex. cancer)

Naissance de la Biologie moléculaire Grandes étapes des avancées en biologie moléculaire Naissance du concept de gène 1865 : Travaux de Mendel : (publiés par De Vris en 1900) théorie de l ’hérédité particulaire 1880-1920 : hérédité chromosomique (travaux de Morgan sur la drosophile) Gène = élément sur chromosome, responsable d ’un caractère Évolution du concept de gène : hérédité moléculaire 1944 et 1952 : Travaux de Avery (pneumocoques) et Hershey et Chase (bactériophages) : ADN = support physique et chimique des gène 1953 : Watson et Crick : double hélice de l ’ADN 1957 : gène et structure primaire d ’une protéine 1961 : Concept de l ’ARN messager “ un gène -une enzyme ” (Jacob et Monod) 1963 : découverte du code génétique (Niremberg, Ochoa et Khoranea) Naissance de la Biologie moléculaire Gène = segment d ’ADN codant une protéine

Depuis 1970 : développement techniques : la révolution génomique (gène =outil = entité manipulable) découverte : - des enzymes de restriction - la transcriptase inverse (ARN ADN) - Techniques de Séquençage des gènes (application au génome humain) - Clonage moléculaire des gènes (≠ clonage organismes) - Trans-genèse animal (souris KO) et végétal (OGM) - Usine cellulaire : production de protéines recombinantes (depuis 1980) - Identification de gènes responsables de maladies (mutations : diagnostic) - Traitement des maladies du gène : thérapie génique (maladies génétiques, cancers) - Thérapie cellulaire

STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS DES ACIDES NUCLÉIQUES

ADN = Acide désoxyribonucléique ARN = Acide ribonucléique Acide nucléique (noyau) (+ mitochondries, chloroplastes, procaryotes) = polymères de nucléotides Nucléotide = base azotée + sucre (pentose) + acide phosphorique nucléoside Bases Purine pentose pentose Pyrimidine Bases puriques Bases pyrimidiques Adénine (A) Guanine (G) Uracile (U) (ARN) Thymine (T) (ADN) Cytosine (C)

Les différents nucléotides Base purique ou pyrimidique N9 : base purique N1 : base pyrimidique = liaison N-glycosidique Groupement phosphate Pentose - ribose (RNA) OH en 2 ’ - désoxyribose (DNA) H en 2 ’ ADN : 4 types de nucléotides Désoxyadénylate Désoxyadénosine 5 ’ monophosphate (dAMP) (dGMP) Désoxythymidilate Désoxythymidine 5 ’monophosphate (dTMP) (dCMP)

Adénylate, adénosine 5 ’monophosphate (AMP) (GMP) AMPc et GMPc ARN Adénylate, adénosine 5 ’monophosphate (AMP) (GMP) AMPc et GMPc Uridylate, uridine 5 ’monophosphate (UMP)

Liaison phosphodiester Union de plusieurs nucléotides : formation des polynucléotides Extrémité 5 ’ PO4 libre Liaison phosphodiester (liaison covalente) 5 ’ 5 ’ DNA pol RNA pol 3 ’ 3 ’ Extrémité 3 ’OH libre ADN ARN A T C G A P OH Extrémité 5 ’ (à gauche) C1 ’ Extrémité 3 ’ (à droite) C3 ’ C5 ’ 5 ’ 3 ’ p ATCGAOH ou ATCGA : ordre des bases = information génétique Oligonucléotide ≠ polynucléotide

- 2 chaînes nucléotidiques (2 brins) antiparallèles Structure tridimensionnelle du DNA: la double hélice (Watson et Crick 1953 prix Nobel en 1962)) - 2 chaînes nucléotidiques (2 brins) antiparallèles 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ Appariement des bases - complémentarité des bases 5 ’ A C G A . 3 ’ C T 3 ’ G C T . G 5 ’ En face de : A on a : T En face de : C on a : G Brin 1 Brin 2 Raisons de cette complémentarité : 1 - encombrement stérique (purine + pyrimidine) 2 - formation de liaisons hydrogène

P P P P T A désoxyribose désoxyribose G C désoxyribose désoxyribose 6 7 1 5 3 5 4 3 2 2 6 1 8 9 P désoxyribose P désoxyribose G C désoxyribose P P désoxyribose - appariement des bases (stabilité relative, possibilité de dénaturation) - séquence des bases = information génétique Ex : 5 ’ CTAGCGGA 3 ’ 3 ’ GATCGCCT 3 ’ Produit = protéine Produit = son musical

Chaîne sucre phosphate - conformation spatiale de l ’ADN 5 ’ 3 ’ Chaîne sucre phosphate Petit sillon Interaction avec des protéines (Facteurs de transcription) 3,4 nm (10 pdb) d entre 2 bases = 34A° Grand sillon Paires de bases 3 ’ 5 ’ 2,0 nm Mise en évidence des propriétés biologiques de l ’ADN Travaux de Morgan : hérédité chromosomique Expérience de transformation des pneumocoques (Avery-Mc Leold-Mc Carty) (1944) Capsule polyosidique Forme S (« smooth ») Forme R (« rough ») virulente Non virulente

La souris reste vivante Mort de la souris Forme S La souris reste vivante Forme R La souris reste vivante Forme S tuées par la chaleur Mort de la souris Mélange forme R + forme S tuées par la chaleur Conclusion : existence d ’un principe transformant R en S Expérience complémentaire : préparation d ’extrait acellulaire de S tuées par la chaleur La souris reste vivante + Protéines Forme R Mort de la souris + ADN Forme R Conclusion : le principe transformant est l ’ADN

Expérience de Hershey et Chase (1952) Capside protéique ADN Bactériophage T2 Problème : ADN ou Protéine qui infecte ? Utilisation de T2 marqués au 32P ou au 35S Protéine marquée au 35S ADN marqué au 32P Eschérichia coli Séparation bactérie et phages et analyse du contenu de la bactérie : présence de 32P pas de 35S ADN pénètre dans la bactérie Multiplication de T2 : 32P retrouvé dans la descendance ADN = support de l ’information génétique

A U C G Structure des acides ribonucléiques (ARN ou RNA) Monocaténaire + court A U C G Appariement possible - épingles à cheveux (mRNA) - tRNA ≠ ADN Sucre = ribose Bases A, C, G et U (≠ T) ARN ribosomial (rRNA) (80%) Ribosomes = “ usine à protéines “ de la cellule : RNA (65%) + protéines (35%) Procaryotes (E.coli) Eucaryotes rRNA 5S et 23 S 50 S 60S 34 protéines r RNA 16S (1542 nucléotides) mRNA 30S 40S 80 S 70 S (S = Svedberg) 21 protéines ARN messager (mRNA) (F. Jacob et J. Monod 1961) = copie de l ’un des deux brins ADN d ’un gène (transcription) Message = Code à trois lettres 3 nucléotides (triplet) = codon spécifique d ’un acide aminé Décodage : grâce aux tRNA

Bras acide aminé Dihydrouridine (DHU) ARN de transfert = tRNA tRNA (adaptateur) codon AA mRNA Acide aminé Bras acide aminé Extrémité 3 ’ Extrémité 5 ’ ribose Bras DHU Bras Ty C ribose 1-méthylguanine Dihydrouridine (DHU) ribose Bras anticodon Structure en feuille de trèfle d ’un tRNA Pseudouridine (y)

l (nm) Propriétés Physico-chimiques des acides nucléiques Absorbance dans l ’UV absorbance DO ADN db [1mg.ml-1] = 20 DO ARN ou ADN monocaténaire = 25 Simple brin Effet hyperchrome Double brin Intérêt : quantification ADN et ARN pureté des Acides nucléiques l (nm) 220 260 300 Dénaturation thermique Température de fusion ADN dénaturé Chaleur Absorbance 260nm Tm fonction :- de la taille de l ’ADN - nombre GC Température °C Tm 80° 100° renaturation refroidissement