Projet créatinine Régulation de la fonction rénale Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE Régulation de la fonction rénale Projet créatinine 1

II- Démarche expérimentale : les réactions PLAN I- Le projet II- Démarche expérimentale : les réactions III- Etalonnage électrochimique 2

I-Le projet 3

1) Le projet La créatinine Où ? Le sang La sueur La salive Les urines REIN Le dosage de la créatinine permet l’évaluation de la fonction rénale produit de dégradation du phosphate de créatine dans le muscle. 4

Le dosage 1) Le projet Insuffisance = 600 – 700 µmol/L ± 20 % Prises de sang régulière Le dosage sanguin A jeun / sans effort physique Taux normal = 65 – 120 µmol/L ± 20 % (homme) 50 – 100 µmol/L ± 20 % (femme) 5

Inconvénient du dosage I- Le projet Actuellement 3 millions de personnes 60 % de séniors 25 % de diabétiques Insuffisance rénale Nécessite du personnel médical Sanguin Invasive Source d’infection / douleur Inconvénient du dosage 6

Notre but Utilisation simple Utilisation simple I- Le projet Notre but Utilisation simple Utilisation simple Dosage par Électrochimie Sueur ? Salive ? Fiable à ± 10 % Fiable à ± 10 % Méthode non invasive Miniaturisation Miniaturisation 7

Déroulement… Salive 1) Le projet Recherches préliminaires Recherches… Définir plus précisément les objectifs/ les contraintes du projet Etablir le cahier des charges Se rendre compte de la réalité du projet Rencontre avec le P. JAOUI Rencontre avec le P. ZAOUI Achat des réactifs Salive Expériences au CIME Expériences au CIME 8

II-LES REACTIONS 9

? Est-ce que ca marche? II- Les réactions Objectif : savoir si les réactions qui mènent à H202 fonctionnent ? 3 réactions 10

De la créatinine à H 2O2 créatinine + H2O créatine + H2O II- Les réactions De la créatinine à H 2O2 créatinine + H2O créatine (1) créatininase créatine + H2O sarcosine (2) créatinase sarcosine + H2O H2O2 (3) sarcosine oxidase 11

Détection du H2O2 peroxydase H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) II- Les réactions Détection du H2O2 peroxydase H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge) Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine => Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL

La troisième réaction 7 puits II- Les réactions La troisième réaction 7 puits Différentes quantités de sarcosine oxydase  la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais …

II- Les réactions Mais… Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…?? On n’arrive pas à contrôler la réaction génant pour la détection

II- Les réactionsc La deuxième réaction créatine + H2O créatine-amidinohydrolase sarcosine + urée (créatinase) Propriétés de l’enzyme : - Transforme 1μmol de créatine / minute - Enzyme à diluer à 2,0-3,0 U/mol Solution de créatinase (μL) 20 40 60 80 100 Contrôle négatif coloration optimum 2nde oxydation Tableau croisé avec concentration=3 U/mol Solution de sarcosine (μL) Solution de sarcosine (μL) Sarcosine : 50 μL à 1,53 U/mol Créatine : 50 μL à 3 U/mol 15

La première réaction On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL II- Les réactions La première réaction On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo  La réaction ne marche pas 

Conclusion Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C II- Les réactions Conclusion Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes  réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différents Changement de pH après la 1ère réaction  inhibation des autres

III- Etalonnage électrochimique 18

Principe Gamme: 50 -> 300 mM - III- Etalonnage + Anode H2O2-> O2 + 2H+ + 2e- Potentiostat A - V Cathode 2H+ + 2e- -> H2 + CE REF WE I EDTA/Tris Hcl +H2O2 Gamme: 50 -> 300 mM Palier de diffusion Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2

1ère cellule électrochimique III- Etalonnage 1ère cellule électrochimique CE: ITO ER Ag,AgCl Balayage: 20 mV/s 500pts mesure pH=8 WE: Au Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte

2ème cellule électrochimique III- Etalonnage 2ème cellule électrochimique CE: Pt ER Ag,AgCl WE: Pt V=450 mV FAUX! Balayage: 20mV/s pH=8 / Ag,AgCl Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel Concentration des ions non constante (tampon dilué!) =>Réfléchir avant d’agir!! Courant capacitif ou autre réaction

3ème cellule électrochimique III- Etalonnage 3ème cellule électrochimique CE: Pt WE: Au Balayage: 20mV/s pH=8 Oxydation de H2O2 ER Ag,AgCl V=450 mV 650 / Ag,AgCl Problèmes possibles: Cinétique H+ Capacité tampon Fuites Mauvaise connection

Conclusion générale Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, capacité tampon Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon Expérience de la recherche