DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA SYPHILIS Dr Patrice Sednaoui Institut Alfred Fournier Paris

Histoire naturelle de la maladie Connue depuis la fin du XVème siècle en Europe Infection d’évolution lente entraînant des complications tardives cardiovasculaires et neurologiques. Schaudinn et Hoffman en 1905 : bactérie spiralée mobile au microscope au fond noir. Wassermann, Neisser et Brucker : RFC pour le diagnostic indirect, utilisant l’Ag cardiolipidique. Pénicilline utilisée dès 1940 pour traiter efficacement la syphilis et les tréponématoses endémiques.

Histoire naturelle de la maladie T. pallidum : transmission sexuelle (risque 1/3) Transmission mère-enfant : risque faible avant 3.5 mois de grossesse, risque élevé pour le fœtus à partir du 4ème mois de grossesse. Transfusion sanguine : contrôle des donneurs, problème chez les toxicomanes intra-veineux. Traitement par la pénicilline + dépistage  baisse des cas de syphilis Toutefois, réémergence des cas récemment : USA Europe de l’est France Rôle du VIH, toxicomanie, ouverture frontières, appauvrissement des populations, changement des mœurs sexuels.

Syphilis — Reported cases by stage of infection: United States, 1941–2003

Primary and secondary syphilis — Rates by state: United States and outlying areas, 2003 Note: The total rate of primary and secondary syphilis for the United States and outlying areas (Guam, Puerto Rico and Virgin Islands) was 2.5 per 100,000 population. The Healthy People 2010 target is 0.2 case per 100,000 population.

Primary and secondary syphilis — Age- and sex-specific rates: United States, 2003

INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE Syphilis Réseau de sites volontaires : DAV, consultations hospitalières, médecins de ville Depuis 2000 Cas : syphilis « infectieuse » (primaire, secondaire, latente précoce < 1an) 2 Questionnaires : clinique et comportemental INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE Syphilis 2000-2004 Hommes : 96% - Femmes : 4% Homosexuels masculins : 84% Age moyen : 36.5 ans Fellation non protégée : pratique à l’origine de la contamination (55%) Co-infection VIH : 61% en 2000 à 42% en 2003 et 2004 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

Nombre de cas de syphilis par stade et par an, France, 2000 – 2003 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE Syphilis (données partielles nov04) Nombre de cas de syphilis par région et par semestre, 2000-1er semestre 2004 INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE

Schéma pathogénique de la syphilis non traitée Période d’incubation silencieuse : environ 3 semaines Phase de syphilis primaire : environ 1 mois Chancre indolore, adénopathie satellite, riche en tréponèmes Phase d’apparition des anticorps sériques Phase de syphilis secondaire : 6 mois à 1 an Phase de dissémination à tous les tissus Poussées successives d’érosions des muqueuses et d’éruptions cutanées, avec adénopathies et signes généraux Phase de syphilis latente asymptomatique : environ 2 à 30 ans Persistance des tréponèmes dans les phagocytes Phase de syphilis tertiaire ou syphilis tardive symptomatique Lésions cutanées, viscérales, cardio-vasculaires ou neurologiques chez 1/3 des patients

Treponema pallidum Famille des spirochaetaceae, genre Borrelia, Leptospira et Treponema 4 sous-espèces de T.pallidum  différentes pathologies T. pallidum subsp. pallidum  syphilis T. pallidum subsp. pertenue  pian T. pallidum subsp. endemicum  bejel T. pallidum subsp. carateum  pinta ou carate (tréponématoses endémiques) Aucun tréponème n’a été cultivé in vitro

Tréponématoses endémiques Pian, Pinta, Bejel  lésions cutanées transmises dès l’enfance par contage direct. Pian : régions inter-tropicales Bejel : régions désertiques d’Afrique et du Moyen Orient Pinta ou Carate : méso Amérique et Amérique du Sud Aucune technique de diagnostic direct ou indirect ne permet de distinguer ces agents pathogènes.

Structure antigénique de T. pallidum Très complexe alors que le génome est très petit (900 Kbp). Grande diversité dans la réponse anticorps mise en évidence par des tests différents. Membrane d’enveloppe  peu immunogène Lipoprotéine de l’espace périplasmique  très immunogène (Lp 47 Kd) Endoflagelles  immunogènes Peptidoglycane  peu immunogène Membrane cytoplasmique  contient le cardiolipide (haptène de Wasserman)

Diagnostic biologique direct Prélèvement des lésions primaires et secondaires (chancre, ganglions, plaques muqueuses) Sérosité qui sourd de l’ulcération Prélèvement entre lame et lamelle Microscope au fond noir : fine bactérie spiralée régulièrement d’une longueur de 5 à 20 µm, mobilité en spirale, flexion, en avant. IFI : intéressant si la lecture est différée Imprégnation argentique de Fontana Tribondeau : peut déformer les spires

Détection génomique de T. pallidum PCR +++ car T. pallidum non cultivable. Dans échantillons biologiques ou T. pallidum sont peu nombreux Syphilis congénitale Neurosyphilis  Situations où l’interprétation sérologique peut être difficile. Liquide amniotique : PCR sensible et spécifique LCR : résultats inconstants Faux négatifs par présence d’inhibiteurs Persistance du génome longtemps après la fin du traitement chez les sujets guéris PCR ne permet pas de différencier T. pallidum de T. pertenue. Technique lourde.

Diagnostic sérologique Très important car tréponèmes non cultivables in vitro. 2 types de réactions selon la matière de l’antigène utilisé. Tests à antigènes non tréponémique (cardiolipides) Tests à antigènes tréponémique détectant des anticorps spécifiques des tréponèmes

Réactions à antigènes non spécifiques VDRL ou RPR Antigène : suspension de microcristaux de cholestérol + cardiolipide +- charbon ou latex coloré Principe : en présence d’anticorps anticardiolipides  agglutination de l’antigène visible à l’œil nu ou au microscope Dilution de dépistage : pure Si positif : dilution de 2 en 2 Intérêt : Anticorps se positivant précocément en primo-infection Bon indicateur d’efficacité du traitement Inconvénient : Peu spécifique Phénomène de zone

Réactions à antigènes tréponémiques THPA FTA abs EIA TPI ou test de Nelson Western blot

Les réactions à antigènes tréponémiques de dépistage TPHA ou hémagglutination passive : Lysat de T. pallidum absorbés sur hématies Intérêt : peu coûteux, simple, spécifique Inconvénients : Se positive plus tardivement Titres peu influencés par l’antibiothérapie Rares faux positifs FTA-abs ou immunofluorescence indirecte : Suspension de T. pallidum fixés sur lame Sérum dilué et absorbé auparavant dans extraits de tréponèmes de Reiter, testicules de lapins, hématies de mouton Intérêt : réaction la plus précoce et la plus sensible Diffcile à standardiser, lecture délicate EIA : Extraits antigéniques natifs ou recombinants Intérêt : automatisable Limites : qualitatif uniquement actuellement

TPHA Antigène : lysat de T. pallidum souche Nichols absorbés sur des hématies (aviaires, humaines, ovines) Principe : la présence d’anticorps spécifiques  hémagglutination des hématies qui forment un voile d’agglutination à la surface des cupules réactionnelles Dilution de dépistage : 1/80 Si positif, dilution de 2 en 2 Intérêt : test facile, peu coûteux, automatisable, spécifique Limites : se positive plus tardivement que le FTA-abs en début d’infection peu influencé par le traitement Quelques faux positifs

Immunofluorescence indirecte (FTA-abs) Antigène : suspension standardisée de T. pallidum fixés sur une lame Principe : le sérum est dilué au 1/5 dans un sorbent (ultrasonat de tréponèmes de Reiter, globules rouges de mouton et de bœuf, extrait de testicules de lapin). La fixation des anticorps aux tréponèmes est révélée à l’aide d’anticorps marqués à la fluoresceine Dilution de départ : 1/200 Si positif, titrage par dilution de 2 en 2 Intérêt : peut confirmer précocement une syphilis débutante. Limites : peu adapté aux grandes séries Faux positif (maladies auto-immunes et infectieuses) Personnel expérimenté Matériel

EIA Antigènes : natifs ou recombinants fixés sur plaque à microtitration Principe : les anticorps fixés sont révélés par les antiglobulines marquées et révélés par substrat chromogène Intérêts : Détecte les IgG et/ou les IgM Lecture spectrophotométrique objective, automatisable Dépistage de grande séries (CTS) Limites : Tests uniquement qualitatifs Ne dispense pas actuellement de réaliser les autres tests si positif

Les réactions tréponémiques de confirmation Détection des IgM spécifiques Western-blot Test de Nelson

Détection des IgM spécifiques 4 techniques : FTA-abs IgM : Sur sérum total Sur fraction 19S IgM après ultracentrifugation SPHA EIA IgM Intérêt : IgM sont les premiers anticorps à apparaître en cas de primo-infection IgM positives = syphilis active Chez le nouveau-né : IgM+ affirme un syphilis congénitale Chez le patient traité : la persistance d’IgM fait craindre un échec thérapeutique et indique la nécessité d’un nouveau traitement

Western blot ou immuno-empreintes sur tréponèmes Il existe plus de 22 antigènes tréponémiques polypeptidiques réagissant avec les sérums de sujets syphilitiques Mais de nombreux essais ont montré que 3 protéines étaient suffisantes et essentielles pour affirmer une positivité : La lipoprotéine membranaire majeure de 47 kD Deux protéines membranaires de 17 kD et de 14.5 kD Intérêt : Réactifs commercialisés prêts à l’emploi Permettant de détecter des IgG et les IgM en 3h Réalisation facile Très sensible et très spécifique Inconvénient Utilisation de tréponèmes pâles provenant de testicules de lapin

Test de Nelson Antigène : tréponème vivant, mobile, en milieu de survie Principe : mettre en présence une suspension de T. pallidum vivants, le sérum du patient décomplémenté et du complément de cobaye  si anticorps spécifiques, activation du complément qui lyse la membrane externe du tréponème  immobilisation en comparaison à un témoin sans complément. Dépistage : sérum au 1/10 = % d’immobilisation Si positif : dilution de 2 en 2 Intérêt : test spécifique longtemps condidéré comme le test de référence Se positive en fin de phase primaire Titres élevés en phase secondaire Titres faibles dans les phases latentes et tardives Limites : Très lourd Entretien de la souche Lecture subjective

Cinétique des anticorps dans la syphilis non traitée FTA IgM : 25 à 30 jours après contamination FTA IgG ou EIA en deuxième position Suivi du VDRL Puis du TPHA Puis enfin du Test de Nelson : 50 à 60 jours Les anticorps augmentent  titres élevés en phase secondaire (6 à 18 mois d’évolution) Chute des anticorps en phase de latence avec VDRL +- Phase III, réascension des anticorps à taux variables

Cinétique des anticorps dans la syphilis traitée Si traitement au début du chancre : les anticorps peuvent rester négatifs Au stade de syphilis primaire, chute rapide des anticorps et disparition en 3 à 6 mois Si traitement plus tardif, chute des IgM et du VDRL, mais persistance d’une cicatrice sérologique en TPHA et +- FTA

Conclusion La syphilis reste un problème mondial de Santé Publique, malgré les disparités de sa prévalence selon les pays et selon la qualité de la prise en charge médicale T. pallidum reste sensible à la pénicilline, ce qui permettrait d’envisager son éradication, ce d’autant que le seul réservoir connu est humain L’impossibilité de cultiver T. pallidum reste un problème majeur à la compréhension de la pathogénèse de la maladie et au diagnostic Le diagnostic sérologique classique associant VDRL-TPHA reste d’un grand intérêt en pratique courante La confirmation par le FTA-abs et/ou par l’immunoblot associés à la détection des IgM est d’une très grande sensibilité.