Croissance et reproduction bactériennes

Reproduction = fabrication d’un nouvel individu Définitions Croissance = accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme Reproduction = fabrication d’un nouvel individu - par union de gamètes (reproduction sexuée) - par mécanisme asexué Remarque : pour une bactérie, la croissance est toujours suivie de la reproduction asexuée

Plan 1- Mécanisme et caractéristiques de la croissance et de la reproduction d’une bactérie 2- Etude expérimentale de la croissance d’une population bactérienne

1- Mécanisme et caractéristiques de la croissance et reproduction d’une bactérie

1-1- Mécanismes de la croissance et de la reproduction

1-1-1- Croissance Réplication du DNA (de l’ADN) ce qui conduit à la présence temporaire de 2 molécules de DNA dans le cytoplasme Synthèse de paroi, de membrane plasmique : allongement de la bactérie Synthèse de constituants cytoplasmiques

1-1-2- Reproduction asexuée par scissiparité

La multiplication (division) bactérienne

La reproduction asexuée la scissiparité Mécanisme : L'unique molécule d’ADN circulaire se réplique (se double), de nouvelles molécules de la paroi et de la membrane plasmique sont synthétisées et les constituants cytoplasmiques voient leur stock doublé. La bactérie s'allonge et se divise en deux par suite d’une invagination de la membrane plasmique et de la paroi formant un septum avec répartition des constituants dans chacune des bactéries filles. Séparation des 2 bactéries filles Conséquences : Mode de reproduction qui n'introduit pas de variabilité génétique chez les bactéries filles qui sont identiques entre elles et identiques à la bactérie initiale Celles-ci forment des « clones » : des bactéries génétiquement identiques entre elles et identiques à la bactérie mère .

1-2- Paramètres caractéristiques de la croissance d’une bactérie

1-2-1- Temps de génération G 1-2-1-1- Définition 1ère partie : Temps nécessaire pour qu’une bactérie se reproduise et donne 2 cellules filles. 2ème partie : En admettant que toutes les bactéries d’une population se multiplient de façon synchrone, c’est donc le temps nécessaire au doublement de la population.

1-2-1- Temps de génération G 1-2-1-2- Expression Soit Dt : la durée pendant laquelle la bactérie se multiplie n fois G = Dt / n

1-2-1- Temps de génération G 1-2-1-3- Paramètres influençant la valeur de G - La nature de la bactérie Le milieu de culture : pour beaucoup de bactéries un milieu glucosé permet une croissance optimale car permettant un meilleur apport énergétique : G le plus petit La température de culture * pour les bactéries mésophiles c’est aux alentours de 30-37°C que G est le plus petit * pour les bactéries psychrophiles c’est aux alentours de 20°C que G est le plus petit * pour les bactéries thermophiles c’est aux alentours de 45°C que G est le plus petit

1-2-2- Taux de croissance r 1-2-2-1- Définition 1ère partie : Nombre de générations par unité de temps. Remarque : si l’unité de temps choisi est l’heure, r = taux de croissance horaire

1-2-2- Taux de croissance r 1-2-2-2- Expression Soit Dt : la durée pendant laquelle la bactérie se multiplie n fois r = n / Dt Donc r = 1/G

1-2-2- Taux de croissance r 1-2-2-3- Paramètres influençant la valeur de r : les mêmes que ceux influençant G - La nature de la bactérie Le milieu de culture : pour beaucoup de bactéries un milieu glucosé permet une croissance optimale car permettant un meilleur apport énergétique : r le plus grand La température de culture * pour les bactéries mésophiles c’est aux alentours de 30-37°C que r est le plus grand * pour les bactéries psychrophiles c’est aux alentours de 20°C que r est le plus grand * pour les bactéries thermophiles c’est aux alentours de 45°C que r est le plus grand

Taux de croissance : nombre de multiplications par unité de temps Plus le taux de croissance est élevée, meilleure est la croissance du microorganisme

2- Etude expérimentale de la croissance bactérienne

2-1- Méthodes d’étude de la croissance

2-1- 1- Dénombrements par comptage des colonies après culture

2-1-1- Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Technique dans la masse (en profondeur) Technique en surface Voir TP

2-1-1- Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Principe : - Des dilutions selon une progression géométrique de raison 1/10 sont réalisées Un volume connu de chaque dilution est introduit dans la masse ou en surface d’un milieu gélosé Après incubation les colonies sont comptées et, là où elles ne sont pas trop nombreuses, il est possible de considérer que chaque colonie provient d’1 ufc présente dans l’inoculum Calcul de la concentration en bactéries dans le produit de départ analysé en tenant compte du volume ensemencé et de la dilution.

Numération en milieu solide dans la masse

2-1-1- Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Remarque : Si faible concentration en bactéries (20 bactéries dans 100 mL) : - nécessité de faire le dénombrement en utilisant un grand volume, - possibilité de procéder par filtration.

2-1-1- Dénombrement des microorganismes en milieu gélosé Remarque : Si faible concentration en bactéries (20 bactéries dans 100 mL) : - nécessité de faire le dénombrement en utilisant un grand volume, - possibilité de procéder par filtration. Principe : - Passage d’un grand volume à travers un filtre dont les pores ont un diamètre inférieur à la taille des bactéries - Toutes les bactéries du volume filtré sont retenues sur le filtre - Dépôt du filtre à la surface d’un milieu gélosé adéquat Après incubation, comptage des colonies qui, si elles ne sont pas trop nombreuses proviennent chacune d’1 ufc - Calcul de la concentration dans le produit filtré.

Schématisation de la technique de filtration sur membrane

2-1- 2- Dénombrements par comptage visuel des microorganismes au microscope

2-1-2- Comptage direct des microorganismes 2-1-2-1- Principe Comptage des microorganismes sur des champs microscopiques Calcul de la concentration des microorganismes dans le produit analysé.

2-1-2- Comptage direct des microorganismes 2-1-2-2- Les diverses techniques Comptage des microorganismes sur des champs microscopiques d’un hématimètre de Malassez, de Thoma ou autre chambre de volume connu (avec possibilité de distinguer cellules vivantes et cellules mortes grâce au bleu de méthylène de Funk ou au bleu Trypan) Comptage des microorganismes près coloration d’un frottis réalisé par étalement d’un volume connu dans un cercle de 1 cm2 : technique de Breed appliquée au lait Technique du DEFT (Direct epifluorescence filter technic)

Escherichia coli en hématimètre de Thoma

Cercle de surface de 1 cm2 sur une lame de Breed

2-1-2- Comptage direct des microorganismes Principe du DEFT Filtration d’un volume de suspension sur une membrane (1 à 5 mL voire plus) Coloration des microorganismes retenues sur la membrane par une molécule fluorescente (orange acridine par exemple colorant les cellules vivantes riches en ARN en rouge orangé et les cellules mortes en vert par fixation sur l’ADN) Repérage et comptage des microorganismes colorées par observation microscopique de la membrane avec un microscope à épifluorescence (observation à l’objectif 100 à l’immersion).

2-1-2- Comptage direct des microorganismes Avantages du DEFT Meilleure sensibilité que les dénombrements en hématimètre car : Dénombrement possible sur un plus grand volume Amélioration de l’observation du fait de la coloration par un fluorochrome Observation en épifluorecence.

Schématisation de la technique du DEFT novembre 2006 Cellule procaryote

2-1- 3- Dénombrement par comptage automatisé des microorganismes

2-1-3- Comptage automatisé des microorganismes Principe : Mise en suspension des microorganismes à dénombrer dans un liquide conducteur de l'électricité (ionique) Aspiration du liquide au travers d'un orifice où sont placées deux électrodes entre lesquelles une ddp est appliquée Si passage d’ une cellule relativement isolante entre les électrodes : diminution de la conductivité, augmentation de la résistance une augmentation de la ddp entre les deux électrodes Détection d’une impulsion à partir d'un seuil, impulsion correspondant à une seule cellule en raison de l'étroitesse de l'orifice. .

2-1-3- Comptage automatisé des microorganismes Inconvénients : Méthode numérant les morts et les vivants Méthode pas applicable dans certaines conditions puisque des particules inertes présentes seront comptées comme des cellules.

2-1- 4- Dénombrement par quantification d’une présence microbienne : turbidimétrie

- Prélèvement mis dans une cuve de spectrophotomètre Dénombrement par quantification d’une présence microbienne : turbidimétrie Principe : - Prélèvement mis dans une cuve de spectrophotomètre - Mesure du trouble dû à la présence de microorganismes car déviation des rayons lumineux par les microorganismes - Existence d’une relation de proportionnalité entre A est proportionnelle à C. A = k . C novembre 2006 Cellule procaryote

Avantages et inconvénients Dénombrement par quantification d’une présence microbienne : turbidimétrie Avantages et inconvénients Méthode très pratique, mais comptant les morts. Nécessité d’au minimum 106 bactéries par cm3 pour faire la lecture sans que la concentration soit excessive. Impossibilité de mesure avec certains milieux ne permettent pas la mesure. Possibilité de perturbation de l’absorption par le milieu d'où l'utilisation d'une longueur d'onde où elle est faible (600 nm par ex.). novembre 2006

2-1- 5- Dénombrement par quantification d’une activité microbienne

2-1-5-1- Dénombrement par quantification de l’ ATP : ATP métrie Relation concentration en ATP et concentration en bactéries Toute cellule vivante produit et consomme de l’ATP Pas de fabrication d’ATP par les bactéries ou cellules mortes. Quantité d’ATP par cellule quasi constante dans une bactérie vivante, donc concentration en ATP proportionnelle à la concentration en cellules Conséquence Suivi de la variation de la concentration en ATP permet de suivre la variation de la concentration en bactéries

2-1-5-1- Dénombrement par quantification de l’ATP : ATP métrie Principe du dosage Possibilité de dosage facilement et rapidement l’ATP par la luciférase : Luciférine + ATP + O2  oxyluciférine + AMP + P-P + CO2 + h (562 nm) Conséquence : concentration en ATP est proportionnelle à l'intensité de la lumière émise CATP = k h

2-1-5-1- Dénombrement par quantification d’ ATP : ATP métrie Intérêts . Méthode très rapide : 1 min, Méthode à seuil de détection très bas. Applications Quantification des microorganismes dans les aliments ou dans des produits environnementaux après lyse des cellules dans un milieu permettant de conserver l'ATP intact Contrôle de l’efficacité des opérations de nettoyage désinfection dans le cadre de l’HACCP après lyse des cellules dans un milieu permettant de conserver l'ATP intact Suivi de culture microbienne

2-1-5-2- Dénombrement par quantification d’un métabolite ionisé : impédancemétrie Principe Activité métabolique libère des molécules ionisées (acides par exemple Production de molécules ionisées responsable d’une diminution de la résistance du milieu et donc de l’impédance en courant alternatif. Conséquence Suivi de la variation d’impédance permet de suivre la variation de production de métabolites ionisés et donc de suivre la variation de concentration microbienne.

2-1-5-2- Dénombrement par quantification d’un métabolite ionisé : impédancemétrie Conséquence Diminution de l’impédance : reflet de l’augmentation de la concentration microbienne

2-2- Résultats des études de la croissance : courbe de croissance et son interprétation

2-2- 1- La scissiparité : multiplication par 2 et ses conséquences

2-2-1- La multiplication par 2 et ses conséquences t= t0 N0 = 1 t1= t0 + G N1 = t2 = t1 + G = t0 + 2G N2 = t3 = t2 + G = t0 + 3G N3 = ……….. tn = t0 + nG Nn =

2-2-1- La multiplication par 2 et ses conséquences t= t0 N0 = 1 = 20 t1= t0 + G N1 = 2 = 21 t2 = t1 + G = t0 + 2G N2 = 2. 2 = 22 t3 = t2 + G = t0 + 3G N3 = 2.4 = 23 ……….. tn = t0 + nG Nn =2n

2-2-1- La multiplication par 2 et ses conséquences t0 N0 t1 (t0+ G)) N1 = 2 X N0 t2 (G+ t1) N2 = 2 X 2 X N0 = 22 x N0 t3 (t0+ G) N3 = 2 X 2 x 2 X N0 = 23 x N0 et ainsi de suite donc N = 2n x N0

La croissance bactérienne N = 2n x N0 N augmente de façon exponentielle La croissance est exponentielle

N = 2n x N0 Comme n = r Dt, alors N = 2rDt x N0

2-2- 2- Courbes de croissance

2-2-2-1- Courbe N = f(t) = 2rDt x N0 Courbe exponentielle Temps

logN = r x log2 x (t-t0) + logN0 2-2-2-2- Courbe log N = f(t) N = 2n x N0 donc logN = n x log2 + logN0 logN = r x log2 x (t-t0) + logN0

logN = r x log2 x (t-t0) + logN0 y = a x x + b logN N Linéaire Exponentielle Temps

2-2-2-3- Les diverses phases de la courbe de croissance 4 5 temps log N Ln N Phase de latence Phase de ralentissement Phase de déclin Phase d'accélération Phase exponentielle de croissance Phase stationnaire

2-2-2-4- Signification de chaque phase a/ Phase de latence Définition : Phase caractérisée par : - absence de multiplications durant cette phase : r = 0 multiplication / h - adaptation du microorganisme au milieu : Synthèse d’enzymes inductibles pour métaboliser de nouveaux constituants Restauration d’enzymes altérées

2-2-2-4- Signification de chaque phase a/ Phase de latence Plus le nouveau milieu est différent de l’ancien : - plus il faudra de temps pour synthétiser de nouvelles enzymes, - plus la durée de la phase de latence est longue Caractéristique : Durée variable de cette phase Durée dépendant : De la composition du milieu De l’âge des microorganismes De l’inoculum de la nature du microorganisme Des microorganismes en phase de déclin mettront plus de temps pour restaurer leurs enzymes altérées Plus l’inoculum est important, plus la phase de latence a une durée réduite

2-2-2-4- Signification de chaque phase a/ Phase de latence Remarque : Microorganismes prélevés en phase exponentielle dans un milieu X Microorganismes réensemencés en milieu X Pas de phase de latence (durée nulle)

2-2-2-4- Signification de chaque phase b/ Phase d’accélération Définition : Phase durant laquelle le nombre de bactéries adaptées et qui commencent à se multiplier devient de plus en plus grand le rythme de multiplications est de plus en plus grand

2-2-2-4- Signification de chaque phase c/ Phase exponentielle Définition : Phase de multiplication optimale au cours de laquelle le nombre de bactéries augmente de façon exponentielle par rapport au temps (lnN ou log N augmente de façon linéaire dans le temps) et donc pendant laquelle : - r est constant et maximum - et donc G constant et minimum.

2-2-2-4- Signification de chaque phase c/ Phase exponentielle Caractéristique : Phase de multiplication optimale durant laquelle la valeur de r est constante et maximale Valeur de r qui dépend : Du microorganisme (§1) Des conditions d’environnement * des facteurs physiques (température, O2, Disponibilité en eau, pH…..) * de la disponibilité en nutriments

2-2-2-4- Signification de chaque phase d/ Phase de ralentissement Définition : Phase pendant laquelle r diminue progressivement jusqu’à devenir nul Causes de son existence : Appauvrissement du milieu en certaines substances nutritives ou en certains gaz Accumulation de certains déchets plus ou moins toxiques

2-2-2-4- Signification de chaque phase e/ Phase stationnaire Définition : Phase pendant laquelle r est nul et N reste constant car il ya équilibre entre : Le nombre de bactéries disparaissant par lyse Le nombre de bactéries apparaissant par multiplication lente Causes de son existence : Dégénérescence d’une partie des microorganismes compensée par l’apparition de nouveaux microorganismes qui utilisent pour se multiplier les molécules libérées par la lyse des autres microorganismes

2-2-2-4- Signification de chaque phase e/ Phase stationnaire Causes de la lyse de certains microorganismes : Epuisement total d’une substance nutritive indispensable appelée substance limitante Accumulation trop grande de déchets toxiques dans le milieu Evolution défavorable de l’environnement physique (ex : abaissement du pH).

2-2-2-4- Signification de chaque phase f/ Phase de déclin Définition : Phase pendant laquelle r est négatif car les microorganismes ne se multiplient plus et beaucoup d’entre eux meurent et sont lysés.

2-2-2-5- Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de latence log N Temps de latence = tL Temps tL

Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de latence Log N Temps de latence = tL Temps tL

Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de génération G logN2 logN1 Log N Lorsque la population double, N2 = 2 x N1 logN2 = log2 + logN1 logN2 = 0,3 + logN1 + 0,3 Temps G

Détermination des paramètres de la croissance : Le temps de génération G lnN2 lnN1 Ln N Lorsque la population double, N2 = 2 x N1 lnN2 = ln2 + lnN1 lnN2 = 0,7 + lnN1 + 0,7 Temps G

logN =r x log2 x (t-t0) + logN0 Détermination des paramètres de la croissance : Le taux de croissance horaire r logN2 logN1 temps log N logN =r x log2 x (t-t0) + logN0 donc pente = a = r x log2 pente donc r = ------------- log2 logN2 - logN1 avec pente = ----------------- t2 – t1 + 0,3 Temps