MOYENS D’ÉTUDE EN CANCÉROLOGIE : Cytosquelette, -produits de sécrétion, -marqueurs de différenciation lymphocytaire… (P. Levillain)

Les filaments intermédiaires Cytosquelette

le cytosquelette : les trois composants principaux microtubules filaments intermédiaires microfilaments d'actine D= 24 nm réseau dont le centre est situé au niveau du centrosome. D= 7 à 15 nm réseau qui occupe tout l'espace cytoplasmique. D= 6 nm réseau principalement localisé sous la surface cellulaire.

Rappels Les fonctions du cytosquelette : Confère à la cellule sa forme caractéristique Assure sa motilité en lui donnant la possibilité d'accomplir des mouvements amiboïdes Permet les déplacements des organites cellulaires Coordonne des fonctions biologiques fondamentales, comme la division cellulaire grâce aux microtubules.

Rappels Les microtubules sont des structures polaires Caractérisées par une extrémité positive, à croissance rapide, et par une extrémité négative, à croissance lente ; La cellule possède des centres d'organisation des microtubules, qui en dirigent la formation : les centrioles, les corpuscules basaux des cils et les centromères. Dans le cas des microtubules évoluant librement dans la cellule, il existe un centre de formation principal à côté du noyau, constitué de deux centrioles perpendiculaires l'une à l'autre (asters), à partir desquelles les microtubules rayonnent, leurs queues négatives étant tournées vers le centre de la formation. Les microtubules sont des structures dynamiques qui se forment et sont détruites en permanence.

le cytosquelette : les trois composants principaux microtubules filaments intermédiaires microfilaments d'actine D= 24 nm réseau dont le centre est situé au niveau du centrosome. D= 7 à 15 nm réseau qui occupe tout l'espace cytoplasmique. D= 6 nm réseau principalement localisé sous la surface cellulaire.

Filaments intermédiaires Les filaments intermédiaires ont été classés en six sous-types : type I : cytokératines acides (de CK9 à CK 20) type II : cytokératines basiques (de CK1 à CK8) type III : vimentine, desmine, glial fibrillary acid protein (GFAP), périphérine type IV : neurofilaments L, M et H, internexine alpha type V : lamine nucléaire type VI : nestine (cellules souches du SNC)

Filaments intermédiaires En pratique on utilise : les cytokératines (épithéliums) la vimentine (tissus conjonctifs, mélanocytes) la desmine (dans les tissus musculaires) la GFAP [glial fibrillary acid protein] (astrocytes ) les neurofilaments (neurones du tissu nerveux)

Cyto-Kératines 1 Les cytokératines dont le poids moléculaire varie entre 40 et 65 kDa, sont caractéristiques des épithéliums (kératinisants ou non). Elles s'accrochent sur les plaques des desmosomes et des hémidesmosomes. Il existe une vingtaine de types de cytokératines qui s'organisent systématiquement en paire avec toujours une kératine acide et une kératine basique dont les poids moléculaires diffèrent de 8 kDa. Exemples de paires : K(1, 2) - K10, K (3) - K (12), K(4) - K13,  K (5) - K(14)....Les paires de kératine exprimées varient en fonction de la position des cellules dans l'épithélium, du type d'épithélium et des organes. Les épithéliums se distinguent ainsi des autres tissus histologiques fondamentaux qui contiennent des filaments intermédiaires différents : desmine, vimentine, GFAP, neurofilaments

Autres filaments intermédiaires desmine dans les tissus musculaires  vimentine dans les tissus conjonctifs, les mélanocytes.... GFAP dans les astrocytes neurofilaments dans les neurones et les cellules neuro-endocrines.

Cytokératines et Diagnostic des carcinomes Lorsque des cellules épithéliales subissent un processus de cancérisation, elles donnent des carcinomes qui reproduisent les caractères spécifiques des épithéliums : la spécificité biochimiques des filaments intermédiaires est telle que la mise en évidence, par des réactions immunohistochimiques, de kératines dans de petits échantillons de cellules cancéreuses, suffit à indiquer leur origine épithéliale Ainsi dans les cas difficiles, au niveau de la tumeur primitive et surtout au niveau des métastases à distance, le diagnostic de carcinome peut être porté grâce à l'immunohistochimie.

Microscopie électronique Peau Epiderme Kératinocyte basal

Applications 1 Anti-cytokératines à large spectre (KL, AE1/A3) : nature carcinomateuse d’une tumeur indifférenciée Cytokératine 5-6 Mésothéliome C épidermoide Cytokératine 7 Cytokératine 20

CK à haut poids moléculaire (prostate)

Autres marqueurs des épithéliums et des carcinomes EMA (antigène membranaire épithélial)

Marqueurs des muscles et des tumeurs musculaires Desmine Autres marqueurs : Actines musculaires lisse et striée H-caldesmone (muscle lisse) Myogénine (associée à la différenciation musculaire striée)

Marqueurs conjonctifs (non musculaires) Vimentine Autres marqueurs du tissu conjonctif : CD 31 : vaisseaux CD 34 : vaisseaux / cellules souches hémato CD 117 : cellules de Cajal, mastocytes

Marqueurs des mélanomes Protéine S 100 HMB 45 (mélanosomes) Melan A Vimentine

Mélanocyte

Tumeurs des tissus mous et filaments intermédiaires : exemples Vimentine Desmine Cytokératines Angiosarcome + - +/- Fibrosarcome Léiomyome Léiomyosarcome Rhabdomyosarc. Liposarcome Synovialosarcome Mésothéliome

Marqueurs du mésothéliome Co-expression cytokératine/vimentine HBME-1 Calrétinine CK 5/6 Négativité des marqueurs d’adénocarcinomes comme l’ACE, le TTF-1…

Autres marqueurs cytoplasmiques Produits de sécrétion Hormones Neuropeptides Protéine S 100 Marqueurs d’organes

Marqueurs nucléaires Récepteurs hormonaux Hormono-dépendance : facteur pronostique Traitement hormonal Dans une tumeur indifférenciée : oriente vers une origine mammaire ou du tractus gynécologique

RE RP

RE

Marqueurs d’organe PSA Thyroglobuline TTF1

anti-P63 (noyaux) et anti-p504s (cytoplasmes) Glandes prostatiques normales p63 + Carcinome urothélial P63 + P504s - Carcinome prostatique P63 - P504s + Prostate : carcinome prostatique et carcinome urothélial de vessie

Marqueurs neuro-endocrines Chromogranine A : granules neuro-sécrétoires Synaptophysine : vésicules sécrétoires remplacent les colorations d’argyrophilie (Grimelius) et d’argentaffinité (Fontana) CD 56 (N-cam) NSE : peu spécifique Leu 7 : (CD57) Typage de la sécrétion : Insuline, gastrine, somatostatine, sérotonine, VIP, glucagon, etc...

Marqueurs de différenciation lymphocytaire CD1 = thymocytes, cellules de Langerhans CD2 = lymphocytes T CD3 = lymphocytes T périphériques CD4 – CD8 = sous-populations de Lc T CD5 = lymphocytes T et certains Lc B CD20 = lymphocytes B CD30 = Cellule de Sternberg, lymphomes anaplasiques à grandes cellules ...

Immunoglobulines Ig de surface Ig intracytoplasmique

Diagnostic de lymphome Phénotype aberrant Monotypie Répartition anormale des sous-populations Type de lymphome

Réactivité de trois anticorps avec 3 types de tumeurs Application Réactivité de trois anticorps avec 3 types de tumeurs Anticorps Carcinomes L.N.H. Mélanomes Anti-leucocytes CD45 - + Anti-cytokératine Anti-EMA +/-

Application

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR ) dominé par les tumeurs rétro-péritonéales. neuroblastome, tumeur du groupe Ewing/PNET néphroblastome blastémateux autre type de tumeur du rein, tumeur rhabdoïde, sarcome à cellules claires. autres tumeurs abdominales ou thoraciques 5. rhabdomyosarcome, 6. synovialosarcome, 7. tumeur desmoplasique intra- abdominale 8. hématopoiétiques (essentiellement sous forme d’adénopathies). Elles sont beaucoup plus fréquentes chez l’enfant que les adénopathies métastatiques des carcinomes indifférenciés ou des mélanomes)

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR ) Les données de la morphologie pures (notamment l’aspect des noyaux peuvent orienter : nucléole éosinophile souvent présent dans les neuroblastomes). Immunomarquages : arbre décisionnel (permet d’utiliser à bon escient les coupes peu nombreuses des ponctions biopsies). Les 3 anticorps utilisés au départ sont Kératine, Vimentine, CD 45RB. A. Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (+) Vimentine (-) CD45RB (-), les possibilités sont restreintes : tumeur épithéliale, blastème rénal (Wilms) deuxième étape immuno rarement nécessaire. Le blastème rénal exprime souvent la desmine qui peut donc être pratiquée dans un second temps, ainsi que WT1

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR ) B. Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (+) Vimentine (+) CD45RB (-), possibilités plus nombreuses 1. Là encore du blastème rénal (Tumeur de Wilms) 2. Tumeur desmoplasique intra abdominale, qui est polyphénotypique, et exprimera en plus un ou plusieurs des antigènes suivants : NSE, CD 99, WT1, desmine et présente une fusion EWS-WT1 détectable par RT-PCR : t(11 ;22)(p13 ;q12) 3. Une tumeur rhabdoïde, également polyphénotypique (EMA, NSE, etc) et qui présente une délétion 22q11.2 4. Un synovialosarcome (rechercher en Biologie Moléculaire la translocation spécifique t(X ;18) 5. Un mésothéliome qui exprimera la calrétinine.

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR ) C . Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (-) Vimentine (+) CD 45RB (-), possibilités également nombreuses 1. Neuroblastome, exprimant NSE, NB 84, pouvant ou non amplifier N-myc 2. Tumeur du groupe Ewing, PNET qui va exprimer NSE, et surtout CD99. Une translocation t(11;22)est la plus fréquente mais d’autres translocations, toujours concernant le Chr 22 sont également possibles. 3. Le blastème rénal peut la encore présenter ce phénotype. 4. rhabdomyosarcomes, positifs pour les marqueurs musculaires classiques et présentant en biologie moléculaire la translocation t(2;13) caractéristique des RMS.

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR ) D . Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (-) Vimentine (-), CD 45RB (+) → prolifération hématopoiètique, B si elle exprime CD20, T si elle exprime CD3, lymphome anaplasique si elle exprime CD 30 et EMA. Attention : CD 99 positif dans la plupart des leucémies et des lymphomes, et dans le chondrosarcome mésenchymateux, il n’est donc pas spécifique des tumeurs du groupe Ewing/PNET.