Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence : (P. Levillain)

Principes généraux Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)

1 - LES ANTICORPS

Les anticorps primaires (ou spécifiques) Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché Il en existe deux types : Les AC polyclonaux Les AC monoclonaux

ANTICORPS POLYCLONAUX Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés

ANTICORPS MONOCLONAUX Technique des hybridomes

Milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome

Anticorps Polyclonaux : Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot Avantages : 1) coût généralement moins élevé 2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense Monoclonaux : - spécificité définie - cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes

Antigènes masqués par la fixation Restauration antigénique Chauffage des coupes histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes) Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé

2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE - ANTICORPS Immunofluorescence

Immunofluorescence directe fluorochrome

Immunofluorescence à deux étages fluorochrome

Microscope à fluorescence (épi-illumination)

Différents types de fluororochromes

Immunofluorescence : Résumé Fluorochrome Fluorochrome INDIRECTE DIRECTE Cryocut Sérums utilisés Dépôts des sérums sur lames Incubation en chambre humide

Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie

Anticorps primaire conjugué péroxydase

PAP

Autres techniques de révélation

Streptavidine biotine

Polymères (type Envision)

Application (méthode streptavidine-biotine) Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation Préparation des Coupes En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)

Application (méthode streptavidine-biotine) Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase » ETAPES TEMPS D’INCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 3% 5 min Anticorps primaire : 1 Variable : de une heure à une nuit Réactif secondaire biotinylé (Linker) : 2 15 min Streptadidine-peroxydase Substrat ( DAB) : 3 5min Hématoxyline 3 min

Résumé du protocole Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Streptavidine-peroxydase Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames

Polymères Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse » ETAPES TEMPS D’INCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 5 min Anticorps primaire (souris ou lapin) Variable : jusqu’à une nuit Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort) 30 min Substrat-Chromogène 3,3’-diaminobenzidine (DAB+) Contre-coloration à l’Hématoxyline 3 min

Résumé polymère (Kit EnVision) Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes Étape 2 : Anticorps primaire Étape 5 : Contre coloration à l’hématoxyline Incubation Étape 3 : Polymère marqué à la HRP Étape 4 : Substrat chromogène

Technique du double marquage

On doit utiliser deux enzymes différentes Technique de double marquage en microscopie optique On doit utiliser deux enzymes différentes

IM et IHC comparaison Difficultés et limites

IF / IHC IMMUNO-FLUORESCENCE : Avantage : faible coût et technique facile et rapide mais - ne permet pas la conservation des lames - peu informative sur la morphologie IMMUNO-HISTOCHIMIE : - permet d’apprécier la morphologie des lésion - permet la conservation des lames

Fixation/Congélation Type d’antigène Tissu fixé Tissu congelé Ag extra cellulaire +/- + Ag membranaire Svt - Ag intra cellulaire

PB = extra cellulaire

Vascularite

HMB 45 Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique) Chromogène : fast red

RP et noyaux

Difficultés liées à la technique Fluorescence : - découplage du fluorochrome (bruit de fond) (=> diminution bruit de fond par Bleu Evans) - fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…) - fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus) - fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites) - « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)

Difficultés liées à la technique IHC : - peroxydases endogènes - biotines endogènes - zones de nécrose - absorption passive (histiocytes)

Difficulté non liée à la technique un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées) CD 10 (cALLA) et cellules du rein CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines