III -La Chromatographie liquide haute performance Les différents type de Chromatographie Liquide L’appareillage La chromatographie d’adsorption La chromatographie de polarité de phase normale La chromatographie de polarité de phase inverse Les modes de travail Les détecteurs Les domaines d’application La chromatographie planaire

1- Les différents types de CL Soluté Phase stationnaire mobile Domaines d’application Masse molaire élevée >10 000 g/mol Espèces non polaires : perméation sur gel Espèces polaires ou ioniques : filtration sur gel Espèces ioniques à faible masse molaire Echange d’ions Petites molécules non ioniques Chromatographie de partage 2 2

2- L’appareillage 2-1- Le chromatographe Chaque paramètre chromatographique doit être optimisé pour assurer l’analyse qualitative et quantitative La phase mobile La phase stationnaire Dimension de la colonne Le volume d’injection Le traitement de l’échantillon Le débit de la phase mobile La température de la colonne Le détecteur Solvants d’élution Dégazeur Collecte de données Pompes Injecteur Colonne Détecteur 3 3

Coefficient de partage eau/octanol 2-2- Les solvants Compatibilité avec le système de détection Pas d’absorption aux longueurs d’onde de travail (détection par absorption) Indice de réfraction de la phase mobile différent de celui des solutés (détecteur réfractomètres) Miscibilité et solubilité des solutés Viscosité Une augmentation de la viscosité diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse : diminution du nombre de plateaux théoriques La pression en tête de colonne augmente proportionnellement à la viscosité de la phase mobile Température d’ébullition Problème de dégazage Pureté des solvants Alcanes transparents jusqu’à 190 nm mais les traces d’oléfines absorbent vers 250 nm Oxygène dissout augmente la longueur d’onde limite de détection Toxicité et dangerosité Attention aux solvants chlorés et aromatiques Force éluante Polarité Coefficient de partage eau/octanol 4 4

2-3- Les problèmes de dégazage et les dégazeurs Détérioration de la colonne Bruit lié à la pompe Problème de détecteur Efficacité du dégazage Les dégazeurs Dégazage à l’hélium Dégazage sous vide Dégazage par ultra sons 5 5

2-4- Les pompes Assurent l’écoulement de la phase mobile dans la colonne Doivent être près puissantes : P = 420 bars Viscosité des solvants Granulométrie de la phase stationnaire Généralement pompes à pistons alternatifs Petit volume interne Pression de sortie élevée (700 bars) Débit constant quelque soit la pression dans la colonne Attention aux propriétés physiques de remplissage des colonnes: doivent résister à de fortes pressions 6 6

Pompe isocratique Pompe binaire: 2 pompes Avantages Pompe quaternaire - 1 seul solvant délivré - Travail en mode isocratique Pompe binaire: 2 pompes Avantages - Faible chambre de mélange - Travail en mode gradient - Mélange des solvants à haute pression - Gradient le plus reproductible (débit et composition extrême) - Gradient le plus rapidement délivré Inconvénients - Plus complexe et plus cher - Problèmes de cavitation avec certains solvants Pompe quaternaire Avantages - Maximum 4 solvants délivrés - Travail en mode gradient - Une seule tête de pompe - Prix plus faible Inconvénients - Moins performants aux conditions extrêmes - Gradient moins précis et reproductible - Nécessite un dégazage en ligne 7 7

2-5- L’injecteur Vanne à haute pression à 6 voies Injection brève pour ne pas perturber le régime d’écoulement dans la colonne Grande reproductibilité 8 8

2-6- La colonne Colonne Diamètre dc Volume VC = VM + VS Généralement courtes et en acier inoxydable Longueur de 10 à 25 cm Diamètre de 4 à 5 mm Elles sont remplies de phase stationnaire Billes de 5 à 10 µm de diamètre Phase liquide déposée sur des billes (silice) Nombre de plateaux théoriques varie de 1000 à 50000 Souvent précédée d’une colonne de garde u Colonne Diamètre dc Volume VC = VM + VS Phase mobile (Eluant) Viscosité  Volume VM = Vi + Vp Vi Intergranulaire Vp Porosité (stagnation) Vitesse d’écoulement u Phase stationnaire Particules de taille moyenne dp Volume VS 9 9

Lois de Darcy P = Pe-Ps : perte de charge L : longueur de colonne Porosité de la colonne Intergranulaire Intragranulaire Totale Perméabilité spécifique de la colonne K0 Facteur de résistance En général : eT = ei 10 10

2-7- Les détecteurs - Termes généraux et concepts Sélectivité Un détecteur non sélectif réagit avec la solution qui passe dans la cellule. quand un composé est élué… Un détecteur sélectif ne réagit pas avec la solution mais mesure une réponse due à une propriété de la molécule de soluté (i.e. UV absorbance) Sensibilité Plus petit signal détectable: signal/bruit=3 Domaine de linéarité Pente et interception Limite de détection et de quantification Limite de détection = la plus petite quantité d’analyte qui peut être détectée (3 fois le bruit de fond) Limite de quantification = la plus petite concentration d’analyte, dans une certaine matrice, qui peut être mesurée (10 fois le bruit de fond) 11 11

Spectrométrie de masse 3-4 10 – 100 fg Détecteur linéarité sélectivité sensibilité UV 5 moyenne 0,5 – 1,0 ng Indice de réfraction 4 faible 1 – 5 µg fluorescence 2 grande 10 – 100 pg Conductivité 10 – 50 ng électrochimique 50 – 500 pg Spectrométrie de masse 3-4 10 – 100 fg 12 12

2-7-1- Détecteur UV-Visible Détecteur le plus utilisé en HPLC Rempli un nombre important de critères du détecteur idéal Sensibilité Linéarité Réponse pas affectée par des fluctuations de température Sélectif et utilisable en gradient d’élution Mesure de l’absorbance : loi de Beer-Lambert

Gamme de longueurs d’onde : 210 – 850 nm 180 – 380 nm : lampe deutérium 380 – 800 nm : lampe tungstène

2-7-2- Le détecteur à barrettes de diodes Détection à une seule  ou à plusieurs  Acquisition dynamique du spectre Obtenir le spectre de chaque composé Détection simultanée à 2  (pureté) Soustraction de  (compensation de dérive de ligne de base) Déconvolution des spectres

Phénomène de co-élution de pics Analyse de pureté de pics avec un D.A.D. ( diode array détector ) : déconvolution

2-7-3- Détecteur fluorimétrique Luminescence Absorption d’un photon : augmentation de l’énergie – passage de S0 à un état singulet S1 ou S2 Perte d’énergie selon différents processus Luminescence (état excité à état fondamental) Photoluminescence lorsque la lumière est source d’excitation Fluorescence Energie absorbée est distribuée en niveau de rotation et vibration Retour à l’état fondamental sans émission de lumière : relaxation Puis émission d’énergie phosphorescence Emission se fait à  supérieur

Monochromateur à réseau concave diffracte la lumière vers la cellule Lentille et miroir focalisent et dirigent la lumière vers le réseau d’émission Cellule en quartz Monochromateur disperse la lumière émise et la dirige vers le photomultiplicateur La lumière est collectée à angle droit et focalisée par la lentille Photocathode qui convertit les photons en électrons Photodiode mesure le spectre d’émission Lampe Spectre entre 200 et 900 nm

3- La chromatographie d’adsorption Phase stationnaire solide Silice ou alumine Phase mobile Caractérisée par la force éluante ε0 : énergie d’adsorption du solvant par unité de surface ε0 pour l’alumine (ε0silice = 80% ε0alumine) Augmentation de ε0 de 0,05 unité diminue k d’un facteur compris entre 3 et 4 Solvant ε0 Fluoroalcanes -0,25 Cyclohexane -0,2 n-hexane 0,01 CCl4 0,18 1-chlorobutane 0,26 Ether isopropylique 0,28 Solvant ε0 Toluène 0,29 Ether éthylique 0,38 Chloroforme 0,40 Dioxane 0,56 Tetrahydrofurane 0,57 Acétate d’éthyle 0,58 Solvant ε0 Nitrométhane 0,64 Acétonitrile 0,65 Méthanol 0,95 Éthanol 0,88 Ethylène glycol 1,11 eau élevée Ordre d’élution des composés Paraffines Oléfines Hydrocarbures aromatiques Halogénures, sulfures Éthers Dérivés nitrés Esters, aldéhydes, cétones Alcools, amines Sulfones Sulfoxydes Amides Acides carboxyliques 19 19

4- Chromatographie de partage 4-1-Généralités Peut être subdivisée en deux Chromatographie liquide/liquide (applications marginales) Phase stationnaire retenue par adsorption sur le support Chromatographie liquide/phase greffée (majorité des applications) Phase stationnaire liée chimiquement au support Support : à base de silice Particules uniformes Particules poreuses et mécaniquement stables Particules de diamètre de 3, 5 ou 10 µm Surface entièrement hydrolysée 20 20

Les phases stationnaires (Obtenues par réaction de silanisation) Réaction d’un chlorosilane (mono, di ou tri) avec les groupements silanols Monochlorosilane fournit un matériel monomérique lié à la surface par une liaison simple (liaison silyl ether) Les phases monomériques sont très efficaces Celles produits avec des di- et tri-chlorosilane sont plus robustes Les phases greffées sont très utilisées car elles changes la chimie de surface et donc la sélectivité 21 21

Les phases mobiles Solvant P’ Solvant P’ Solvant P’ Classées selon leur polarité: indice de polarité de Snyder (P’) basée sur des mesures de solubilité de la substance étudiée dans 3 solvants Dioxane (accepteur de proton à faible moment dipolaire) Nitrométhane (accepteur de proton à moment dipolaire élevé) Éthanol (donneur de proton à moment dipolaire élevé) Solvant P’ Fluoroalcanes <-2 Cyclohexane 0,04 n-hexane 0,1 1-chlorobutane 1,0 CCl4 1,6 Ether isopropylique 2,4 Solvant P’ Toluène 2,4 Ether éthylique 2,8 Tetrahydrofurane 4,0 Chloroforme 4,1 Ethanol 4,3 Acétate d’éthyle 4,4 Solvant P’ Dioxane 4,8 Méthanol 5,1 Acétonitrile 5,8 Nitrométhane 6,0 Ethylène glycol 6,9 eau 10,2 22 22

4-2- Chromatographie à polarité de phase normale (NP) Définition: la chromatographie en phase normale utilise une phase stationnaire plus polaire que la phase mobile Phase stationnaire: silice greffée cyano, diol et amino Phase mobile: hexane, chloroforme, ethylacétate Les analytes polaires sont retenus plus longtemps dans la colonne que les composés moins polaires Le groupe le plus polaire guide la rétention la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche PHASE NORMALE adsorbant polaire et très polaire la polarité de l'échantillon augmente CH3 : les moins retenus Aromatiques : rétention plus forte du fait des électrons  Halogènes : moment dipolaire Ether Nitro Ester Aldéhyde Cétone Alcool : liaisons hydrogène Amine Amides Acides 23

Optimisation de la phase mobile Différents solvants peuvent modifier la sélectivité Utilisation de nomographe Exemple Élution par 92% n-pentane – 8% methylacétate Faible sélectivité Durée correcte Remplacement par 62% n-pentane 38% methylènechloride 24 24

4-3- Chromatographie à polarité de phase inversée (RP) Définition : la chromatographie en phase inverse utilise une phase stationnaire moins polaire que la phase mobile Phase stationnaire est hydrophobe et liée chimiquement à un support de silice: octadecylsilyl (C18), octylsilyl (C8) et C4 Phase mobile: eau, acétonitrile, méthanol, THF, tampons la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche PHASE INVERSÉE adsorbant peu polaire la polarité de l'échantillon augmente 25 25

L’eau est le solvant le plus faible car il est le plus polaire - repousse les analytes hydrophobes vers la phase stationnaire - les temps d’analyse sont longs Le modificateur est moins polaire que l’eau - l’analyte est moins repoussé vers la phase stationnaire - temps de rétention plus faible Plus on ajoute de modificateur plus les temps de rétention sont courts Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

Utilisation d’un nomographe Permet de sélectionner un autre solvant Pour une durée d’élution à peu près identique( isoéluotropique) Pour une sélectivité différente 28 28

Rétention en chromatographie de phase inverse Le caractère hydrophobe est le premier indicateur d’une rétention le caractère hydrophobe s’exprime par log P (partition entre eau – octanol) plus log P est grand plus le composé est hydrophobe L’ordre d’élution est gouverné par la solubilité et le nombre d’atome de carbone moins le composé est soluble, plus la rétention est grande la rétention augmente avec le nombre d’atomes de carbone les composés ramifiés sont élués plus rapidement que leurs isomères linéaires les insaturations diminuent la rétention L’ordre général d’élution est: les espèces ioniques sont élués avec les volumes vides acides forts acides faibles bases faibles dipôles permanents dipôles induits aliphatiques Rétention croissante Solubilité dans l’eau croissante 29 29

5- Les modes de travail Mode isocratique la composition de la phase mobile reste inchangée Certains problèmes peuvent survenir grande diversité de polarité des analytes temps d’élution long mauvaise sensibilité pour les composés très retenus car les pics sont larges possibilité de rétention irréversibles conduisant à des contaminations Mode à gradient d’élution la composition de la phase mobile change au cours de l’analyse la composition initiale est choisie pour séparer les composés les plus rapidement élués la force d’élution est augmentée pour éluer les composés avec une sélectivité optimum la composition finale est choisie pour éluer l’ensemble des composés dignes d’intérêt il est possible d’augment la force éluante pour éliminer les composés très retenus pouvant conduire à des contaminations 30 30

  Phase normale ( LC-NP) Phase inverse (LC-RP) Gradient d’élution Polarité croissante de l’éluant     Polarité décroissante de l’éluant  Exemple  Hexane + proportion croissante d’acétate d’éthyle Eau d’acétonitrile Ordre d’élution Les solutés les moins polaires sont les plus rapides Les solutés les plus polaires sont les plus rapides

6- Optimisation L’efficacité a une grande influence sur la résolution Les paramètres ayant une influence sur l’efficacité sont Longueur de la colonne (doubler la longueur double N) Taille des particules dP Volume vides Débit 32 32

La sélectivité a une grande influence sur la résolution Les paramètres ayant une influence sur la sélectivité sont La phase mobile La température La phase stationnaire Le meilleur moyen de modifier la rétention est de changer la force du solvant une augmentation de 10% du modificateur diminue k d’un facteur 2 ou 3 Le gain maximal de la résolution est quand k est compris entre 1 et 5

Exercice d’application : Les facteurs de rétentions de 2 solutés sur une colonne C18 (L = 15 cm ; dC = 4,6 mm; e = 70% ) sont respectivement 0,96 et 1,07 ; La phase mobile est un mélange H2O/MeOH 40/60 ; Le temps mort est tm = 2,3 min On décide de doubler la longueur de colonne en conservant le même débit ; A ) Déterminer : - Le volume mort de la colonne - Les temps de rétention et le temps mort du système - Les facteurs de rétention

B ) Comment vont évoluer les paramètres suivant : - La sélectivité - L’efficacité - La résolution

7- La chromatographie de surface ou planaire Elle peut se faire Sur papier Sur couche mince (plaque d’aluminium ou de verre sur laquelle est déposée la phase stationnaire) Elle exploite les phénomènes: D’adsorption De partage D’échange d’ions La phase stationnaire Silice, alumine, cellulose Plus un composé est polaire plus il sera fortement adsorbé La phase mobile Solvants plus ou moins polaires purs ou en mélange Plus l’éluant est polaire plus les composés se déplacent rapidement 36 36

CCM (Chromatographie sur Couche Mince) Principe: adsorption La phase stationnaire solide est fixée sur un support adsorbant inerte. La phase mobile, non miscible avec la phase stationnaire, migre par capillarité. Révélation UV Diiode, permanganate, ou autres réactifs chimiques spécifiques Rapport frontal Rf Résolution R Efficacité N hi H 37 37