Différenciation des cellules intestinales stem cell -Math1 -Math1 +Math1 Matrice extracellulaire p27 Cellules sécrétrices Cellules absorbantes ? ? ngn3 cellules de Paneth cellules en gobelet cellules endocrines

La voie Notch dans la différenciation intestinale

Signalisation Notch Notch: molécule transmembranaire 4 récepteurs (notch 1, …) et 5 ligands (delta 1-3 -4 ou jagged 1-2) Lorsque notch interagit avec son ligand): Clivage de la partie intracellulaire de notch (Notch IntraCellular Domain), translocation dans le noyau Activation de la transcription de gènes « interrupteur »

Notch et différenciation Notch est impliqué dans le devenir des cellules lors du développement Chez l’adulte, permet le maintien de l’homeostasie Cibles de la signalisation Notch: Math-1, Hes-1, ngn3 qui sont impliqués dans la différenciation Surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices. La signalisation notch est essentielle dans les cryptes pour maintenir l’état indifférencié et prolifératif des cellules progénitrices.

Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine Fre et al. Nature (2005) 435; 964-968

introduction Les signaux via Notch sont impliqués dans le développement de nombreux types cellulaires (cellules nerveuses, hématopoïétiques,…). La modulation de ces signaux peuvent donc affecter la différenciation, la prolifération, l’apoptose des cellules. Notch est un inhibiteur de la différenciation de nombreux types cellulaires math-1, ngn3 modulent la différenciation. Ces facteurs sont contrôlés par Notch Rôle du signal Notch dans la différenciation et la prolifération des cellules précurseur dans l’intestin

stratégie Création de souris transgéniques Expression d’une forme constitutivement active de Notch Utilisation du promoteur de la villine: la forme constitutivement active de la villine est présente dans toutes les cellules intestinales y compris dans les cellules souches.

Effet sur la différenciation (cellules en gobelet) Coloration au bleu cyan Cellules en gobelet WT Notch actif

Effet sur la différenciation (cellules endocrine) Marquage de la chromogranine A (Marqueur général des cellules endocrines) WT Notch actif

conclusion L’expression de Notch entraîne la déplétion de cellules en gobelet et des cellules enteroendocrines

Notch et cryptdine wt Notch L’expression constitutive de Notch inhibe l’expression de cryptdine et donc la différenciation des cellules de Paneth

Donc… L’expression de notch constitutivement active provoque la déplétion des cellules sécrétrices À rapprocher du résultat suivant: la surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices.

Notch et facteurs de transcription wt L’expression constitutive de Notch entraîne: la surexpression de Hes-1, la sous-expression de Math-1 et de Ngn3

Notch et Hes-1 localisation de Hes-1 Notch augmente la concentration nucléaire de hes-1 wt notch

La surexpression de notch entraîne la déplétion des cellules sécrétrices en modulant l’expression des facteurs de transcription. stem cell Notch +Math1 -hes1 Cellules sécrétrices ? ? ngn3 cellules de Paneth cellules en gobelet

Statut d’autres facteurs de transcription regulés par notch Hes5, Hey-1… Pas d’effet de notch sur ces facteurs

Effet de notch sur la prolifération Selon le contexte cellulaire, la signalisation Notch peut influencer la prolifération cellulaire. Qu’en est il dans l’intestin? Ki67 wt Notch

Effet de notch sur la prolifération Brdu (marquage 30’ sacrifice 24 heures après) wt Notch

Conclusion Notch augmente le nombre de cellules qui prolifèrent (Expansion du compartiment de prolifération) Pourquoi en Wt y a t’il des cellules Brdu + dans la villosité)?

Notch et morphologie wt Notch Notch diminue le nombre de microvillosités au niveau du domaine apical

WT Notch Microvillosités moins uniformes et moins rigides Ressemble a des cellules immatures, faiblement différenciées

conclusions La signalisation Notch semble importante dans l’intestin et particulièrement dans les cryptes. Notch empêche la différenciation en modulant l’expression de Hes-1, ngn3,… Elle maintient l’état indifférencié et prolifératif des cellules des cryptes Interrelations avec d’autres voies ( voie wnt) voir TD2

Différenciation des cellules de Paneth

Cellules de Paneth Cellules sécrétrices (lysosyme, cryptdines, defensines) Cellules localisées dans les cryptes Elles achèvent leur différenciation lors de leur migration dans la base des cryptes.

De la cellule souche à la cellule de Paneth MORT (autophagie) Différenciation Tris (rester dans les cryptes) Spécification (secretion) Auto-renouvellement Cellule souche

Différenciation des cellules sécrétrices stem cell -Math1 Hes1 +Math1 Hes1 Cellules sécrétrices Cellules absorbantes ? ? ngn3 cellules de Paneth cellules en gobelet cellules endocrines

Hes-1-deficient mice show precocious differentiation of paneth cells in the small intestine Suzuki et al., 2005 Biochem Biophys Res Commun 328 (2005) 348-352

introduction Hes-1, facteur de transcription (régulé par Notch) souris déficientes en Hes-1: différenciation excessive des cellules endocrines (pancréas) Utilisation de souris KO pour Hes-1: étude du role de Hes-1 sur la différenciation des cellules de Paneth. Utilisation des souris juste après la naissance. A ce stade, il n’existe pas de cellules de Paneth dans les intestins de souris normales

Expression du lysosyme et des cryptdines dans les intestins murins RT-PCR semi quantitative

conclusion Lysosyme: augmentation des ARNm dans l’intestin des souris KO Hes1 Idem pour les cryptidines -1, -4, -5 Hes1 module négativement l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

Expression de marqueurs in situ Hes1 Hes-1: pas de Hes-1 dans les cellules Ko pour cette molécule.

Expression de marqueurs in situ lysosyme Lysosyme positive cells Villus intervillous WT 0 0,03 Ko 0,8 0,49 WT Ko Hes1

Expression de marqueurs in situ cryptdine-4 cryptidine positive cells Villus intervillous WT 0 0,21 Ko 2,7 0,82 WT Ko Hes1

conclusions Cellules difficilement détectables dans les souris normales Augmentation de l’expression dans les souris hes1 KO Développement précoce de cellules de paneth dans les souris KO Hes1 a un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules de Paneth Présence des cellules de Paneth dans les villosités: Hes1 jouerait un rôle dans la distribution des cellules (tri)

Microscopie electronique WT KO Souris KO Hes1: présence de cellules contenant de nombreux granules (cellules de Paneth)

Expression de Ki67 WT KO Ki67: présence dans les cellules progénitrices capables de proliférer. Hes1KO: présence de cellules progénitrices dans la villosité. Hes1 module la localisation des cellules progénitrices

Les souris déficientes en Hes-1 possédent une différenciation précoce par rapport aux souris normales. Hes1 joue un role inhibiteur dans la différenciation des cellules de Paneth

Différenciation des cellules de Paneth Autres voies impliquées… EphB/ephrinB ephB(récepteurs)/ephrinB(ligands) ephB: récepteurs à tyrosine kinase Leur interactions implique des interactions cellule-cellule: répulsion des cellules. Variation d’expression des ephrines dans l’axe’ crypte/villosité Mutation d’une ephrinB

Marquage du lysosyme EphB mutée WT EphB mutée EphB/ephrinB contrôle la localisation des cellules de Paneth.

Différenciation des cellules de Paneth Autres voies de signalisations impliquées… Wnt

La voie Wnt En absence de voie wnt, la b-caténine est associée a un complexe: ubiquitinilation et dégradation l’activation de la voie wnt inhibe le complexe, la b-caténine est stabilisée, transloquée dans le noyau. Interaction avec les facteurs de transcription TCF: transcription de gènes spécifiques.

Implication de la voie wnt dans l’intestin Dans les cellules qui prolifèrent, il y a accumulation de b-catenine nucléaire et de Tcf4: forte signalisation wnt L’activation de la voie wnt entraîne la formation d’adénomes

Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts Van Es et al. Nature cell biology (2005) 7. 381-386 Utilisation d’embryon de souris TCF- Analyse de l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

Localisation de TCF4 et de b-caténine dans l’intestin normal b catenin Tcf 4

conclusion Les noyaux des cellules de Paneth contiennent une accumulation de b-catenine et de Tcf-4: la voie wnt est sans doute impliquée.

Hybridation in situ WT WT WT: si les cellules de Paneth ne sont pas morphologiquement observables dans les embryons, certaines cellules expriment des cryptdines Ko TCF: pas d’expression de cryptdines

conclusion Souris normales: expression de cryptdines Souris Tcf4-: perte d’expression des cryptdines Tcf4 participe à la différenciation des cellules de Paneth

La voie Wnt Différents récepteurs Frizzled: Frizzled 5 et frizzled 6 sont fortement exprimés dans l’intestin normal. fz6: dans toutes les cellules épithéliales sauf les cellules de Paneth Et fz5?

Localisation de frizzled 5 embryon adulte Frizzled 5 est localisée uniquement dans les cellules de Paneth Activation de la voie wnt via activation de Fz5? Souris mutantes pour Fz5…

Localisation du lysosyme Ko FZ5 WT Les cellules de Paneth sont distribuées de façon aléatoire le long de l’axe crypte-villosité si Fz5 mutée. Fz5 participe à la localisation des cellules de Paneth.

Et l’EphB/ephrineB? Souris FZ5- Les cellules de Paneth mal positionnées n’expriment pas ephB…Qui est un gène cible de Tcf4 Fz5 activerait la voie wnt , qui activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

b-catenine Souris Fz5- La b-catenine nucléaire est absente des cellules de Paneth mal positionnées Fz5 activerait la voie wnt , la beta catenine transloque dans le noyau et interagit avec Tcf4. Cela activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

Frizzled 5 Expression de Eph B Positionnement Des cellules de Paneth dans les cryptes Expression de Eph B