Système de sécrétion de type II Sécrétine Wartel Morgane - M2 MBVB

La sécrétion Milieu extérieur ME Périplasme MI Cytoplasme Figure 1 Sécrétion chez les bactéries à Gram – MI : Membrane interne ME : Membrane externe

Les différents systèmes de sécrétion Type VI secretion system Büttner and Bonas, 2002 Figure 2 Les différents de systèmes de sécrétion

Le système de sécrétion de type II Milieu extérieur ME 2. Sécrétion Périplasme MI 1. Exportation (SEC ou TAT) Cytoplasme Figure 3 Sécrétion en 2 étapes

Le système de sécrétion de type II OM IM Filloux, 2004 Figure 4 Modèle d’assemblage du TIISS

Les sécrétines Les sécrétines sont des protéines qui forment de larges canaux dans la membrane externe Les sécrétines sont impliquées dans différents processus : - le système de sécrétion de type II - le système de sécrétion de type III - les pili de type IV - la sécrétion des bactériophages filamenteux

Les sécrétines Les sécrétines forment des complexes multimériques (12 à 15 SU) très stables. Bitter, 2003 Figure 5 Monomère de sécrétine (A) ; Complexe de sécrétines (B) Les dimensions indiquées et le nombre de monomères (SU) présents dans le complexe final varient d’un système à l’autre

Quelques exemples de sécrétines Les sécrétines Quelques exemples de sécrétines PilQ chez N. meningitidis et M. xanthus OutD chez E. chrysanthemi PulD chez K. oxytoca Pili de type IV Partie C terminale commune Partie N terminale variable TIISS

Figure 6 Multimère de PulD La sécrétine PulD - protéine intégrale de la membrane externe de 68 Kda - possède un peptide signal en N-terminal - forme un dodécamère (12 SU) dans la membrane externe très stable - copurifie avec PulS 14 nm 7 nm Figure 6 Multimère de PulD

La sécrétine PulD PulS : chaperonne spécifique de PulD nécessaire pour la protection de PulD de la protéolyse nécessaire pour la localisation de PulD dans la membrane externe

La sécrétine PulD PulD peut s’insérer dans la membrane externe si : elle est exportée dans le périplasme (via SEC) elle est localisée à la membrane externe grâce à PulS → Rôle de PulS ?

Novembre 2006, The EMBO Journal Bacterial outer membrane secretin PulD assembles and inserts into the inner membrane in the absence of its pilotin Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Andreas Engel, Anthony P Pugsley, and Nicolas Bayan Novembre 2006, The EMBO Journal

Figure 8 Dodécamère de PulD Introduction - Domaine N : prolongements dans le périplasme ; contient le peptide signal (SEC) - Domaine C (262-616) : région de la membrane externe obtenue par protéolyse limitée - Domaine S : site de liaison pour la chaperonne PulS N— —C 1 262 616 660 Domaine C Domaine N Domaine S Périplasme Membrane externe Liaison PulS Chami M. et al, 2005 Figure 8 Dodécamère de PulD En bleu: domaine C Figure 7 Schéma de PulD

Introduction Etude de la multimérisation et l’insertion dans la membrane de 2 formes de PulD : PulD : forme WT PulD-CS : domaines C et S fusionnés au peptide signal → Expression dans l’hôte hétérologue E. coli N— —C 1 262 616 660 Domaine C Domaine N Domaine S Périplasme Membrane externe Liaison PulS N— —C Domaine C Domaine S

I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe 30 % de sucrose 60 % de sucrose Echantillon Figure 9 Localisation des monomères de PulD et PulD-CS en présence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD) → PulD-CS est principalement localisée dans la membrane externe en présence de PulS

I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe Figure 10 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD-CShis en présence de PulS (solubilisation des multimères avec ZW3-14, purification sur colonne de cobalt) : Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis → PulD-CS forme un multimère

I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe PulD-CShis PulD 14 nm 7 nm A B C Chami M. et al, 2005 Figure 11 A: Microscopie électronique à transmission de PulD-CShis purifiées en présence de PulS B: Microscopie cryo-électronique du complexe PulDhis en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté C: Schéma d’un multimère de PulD-CShis → Comme PulD, PulD-CS forme un dodécamère localisé dans la membrane externe → Le domaine N n’influence ni la dodécamérisation, ni la localisation dans la membrane externe

II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS Figure 12 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD-CShis en présence ou non de PulS : Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis → PulD et PulD-CS forment des multimères en absence de PulS

II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS PulDhis D PulD-CShis PulDhis + PulS PulD-CShis + PulS C A Chami M. et al, 2005 Figure 13 Microscopie électronique à transmission (B; C; D) et cryo-électronique (A) A: PulDhis purifiées en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) B: PulDhis purifiées en absence de PulS C: PulD-CShis purifiées en présence de PulS D: PulD-CShis purifiées en absence de PulS Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté → PulD et PulD-CS forment des dodécamères en absence de PulS

II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS % sucrose 30 60 Membrane interne Membrane externe Figure 14 Localisation des multimères de PulD en absence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose → Les multimères de PulD et PulD-CS sont localisés dans la membrane interne en absence de PulS → PulD et PulD-CS ne forment pas d’agrégats en absence de PulS

III – En absence de PulS, PulD s’insère dans la membrane interne PulD-CS Figure 15 Microscopie électronique de vésicules de membrane internes de E. coli (purifiées à partir du gradient de sucrose) produisant PulD (A); ou PulD-CS (B) en absence de PulS. : Multimère de sécrétine Selon les auteurs, les vésicules de membrane interne portent des multimères de PulD ou PulD-CS

III – En absence de PulS, PulD s’insère dans la membrane interne L’urée permet de libérer les protéines périphériques de la membrane interne, mais pas les protéines intégrales de la membrane interne Figure 16 Extraction de PulD-CShis, de PspA et SecG par différentes concentrations d’urée (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD, AC α-PspA, AC α-SecG) PspA: protéine périphérique de la membrane interne SecG: protéine intégrale de la membrane interne Selon les auteurs, PulD-CS et PulD se comportent comme des protéines intégrales de la membrane interne

III – En absence de PulS, PulD s’insère dans la membrane interne Définition de la réponse au choc phagique : Elle a lieu suite à la perméabilisation de la membrane interne d’E. coli. Elle est caractérisée par une production massive de PspA. Figure 17 Les protéines de la membrane interne sont séparées par SDS-PAGE puis révélées avec des AC-anti PspA → En l’absence de PulS, il y a induction de la réponse au choc phagique

III – En absence de PulS, PulD s’insère dans la membrane interne Figure 18 Induction de la production de PspA en présence de différentes formes de PulD, en absence de PulS (Western blot avec AC α-PulD et AC α-PspA) D640::TEV: forme efficacement des multimères D281::TEV et N533::TEV: ne forment pas de multimères → La réponse au choc phagique est dépendante de la multimérisation de PulD → L’ensemble des résultats prouve qu’en absence de PulS, PulD et PulD-CS s’insèrent dans la membrane interne, et forment probablement un pore

Discussion PulD-CS est adressée à la membrane externe en présence de PulS PulD-CS forme des dodécamères « PulD-like » dans la membrane externe en présence de PulS → La moitié C terminale de PulD (domaines C et S) est un module autonome pour la dodécamérisation et pour l’insertion dans les membranes → La moitié N terminale n’influence pas ces 2 propriétés → Quel est l’intérêt d’avoir produit PulD-CS pour la suite de l’article ?

PulS n’est pas nécessaire pour la formation des dodécamères de PulD Le rôle de PulS est d’empêcher la localisation des dodécamères de PulD dans la membrane interne En absence de PulS, les dodécamères de PulD s’insèrent dans la membrane interne car : - les vésicules de membrane interne contiennent des multimères de PulD - Le test à l’urée suggère que PulD est une protéine intégrale de la membrane interne - L’induction de la réponse au choc phagique dans les cellules produisant PulD sans PulS est en accord avec la formation d’un pore dans la membrane interne

→ PulD est une protéine de membrane externe qui peut s’insérer efficacement dans la membrane interne pour former un pore en absence de sa chaperonne

In Vitro Multimerization and Membrane Insertion of Bacterial Outer Membrane Secretin PulD Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Catherine Berrier, Alexandre Ghazi, Andreas Engel, Anthony P. Pugsley and Nicolas Bayan Juin 2008, JMB

Introduction 2 formes de PulD sont étudiées dans cet article : PulD : forme native sans le peptide signal PulD-CS : domaines C et S → Expression dans l’hôte hétérologue E. coli pour les expérience in vivo (en+ IPTG) N— —C Domaine C Domaine N Domaine S Périplasme Membrane externe Liaison PulS N— —C Domaine C Domaine S

Introduction PulD et PulD-CS sont synthétisées in vivo et in vitro sans leur peptide signal Etude de l’insertion de PulD et PulD-CS dans la membrane interne de bactéries et dans des liposomes artificiels Etude 2 autres sécrétines : - OutD de E. chrysanthemi, nécessite OutB (PulS-like) pour sa localisation dans la membrane externe - PilQ de N. meningitidis, nécessite PilW et Omp85 pour sa multimérisation et son insertion dans la membrane externe

Arrêt au bout de 30 minutes I – Synthèse et multimérisation de PulD, OutD et PilQ sans leur peptide signal, in vivo (e) Croissance en +IPTG Arrêt immédiat Arrêt immédiat Arrêt au bout de 30 minutes Croissance normale Croissance normale Figure 19 Synthèse in vivo de différentes sécrétines. Analyse par Western Blot. : Sans traitement ; U : Traitement à l’urée ; P : Traitement au phénol → PulD et OutD pourraient multimériser in vivo en absence de leur peptide signal → PilQ ne multimériserait pas in vivo en absence de son peptide signal → La capacité de PulD, OutD et PilQ à multimériser est en accord avec leur toxicité

II – Synthèse et multimérisation de PulD en présence de lipides, in vitro Figure 20 Synthèse in vitro de PulD et PulD-CS en présence de Brij-35 (1 et 2) ou de liposomes (3 et 4) (western blot avec AC α-PulD et AC α-PulD-CS) : Pas de traitement; + : Traitement au phénol → Le détergent Brij-35 inhibe la multimérisation de PulD in vitro → Les liposomes semblent stimuler la formation de multimères de PulD in vitro

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro Centrifugation à 23000g pendant 10 minutes Culot : - Liposomes - PulD et PulD-CS - GFP (protéine soluble) ? → PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro Figure 21 Localisation de PulD synthétisée in vitro en présence de liposomes par flottaison sur gradient de sucrose (Western blot avec AC α-PulD) → Les liposomes marqués avec un colorant fluorescent flottent en haut du gradient (35% de sucrose) → PulD et PulD-CS flottent en haut du gradient (35% de sucrose) → Ceci suggèrent que les multimères de PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes GFP flotte en haut du gradient (35% de sucrose)

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro Culot Centrifugation 23000g 10 minutes Culot + Urée Centrifugation 285000g 30 minutes Figure 22 Effet de l’urée sur la sédimentation de PulD et PulD-CS synthétisée in vitro en présence de liposomes (traitement au phénol, analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie) : Sans traitement; + : Traitement à l’urée → La GFP n’est pas retrouvée dans le culot → PulD et PulD-CS sont retrouvées dans le culot après le traitement à l’urée → PulD et PulD-CS seraient insérées les liposomes

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro Figure 23 Analyse par microscopie électronique de PulD-CS (a) et PulD (b) synthétisées in vitro en présence de liposomes Multimère de sécrétine inséré dans le liposome Encadré: Multimère de sécrétine purifié avec ZW3-14 Vue de côté Vue du dessus PulD-CS PulD → On observe des multimères de PulD-CS et de PulD → Les multimères de PulD-CS sont similaires aux multimères de PulD-CS extraits de membranes bactériennes → PulD-CS s’assemble en complexe dodécamérique dans les liposomes

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro Figure 24 Analyse par microscopie cryo-électronique de PulD-CS synthétisées in vitro en présence de liposomes Encadré: Image moyennée Selon les auteurs, la présence de multimères dans le périmètre du liposome suggère qu’ils sont insérés dans la membrane

IV – Multimérisation de OutD et PilQ in vitro Figure 25 a : Microscopie électronique de OutD synthétisée in vitro en présence de liposomes. : Multimère de OutD b : Synthèse in vitro de PilQ en présence de Brij-35 (+ Brij) ou de liposomes (+ Lip) (Western blot avec AC α-PilQ) → Les multimères de OutD sont associés à la membrane des liposomes → PilQ forme uniquement des monomères en présence de liposomes

Discussion In vivo et in vitro, PulD et OutD en absence de leur peptide signal, peuvent multimériser et s’insérer dans une bicouche lipidique In vivo et in vitro, PilQ en absence de son peptide signal, ne formerait pas de multimères en présence d’une bicouche lipidique → Ces résultats concordent avec le besoin ou non de facteur(s) additionnel(s) pour la multimérisation de la sécrétine et son insertion dans la membrane

Utilisation d’un système de transcription-traduction couplé in vitro qui permet en présence de liposomes de synthétiser, d’assembler et d’insérer dans une membrane un complexe multimérique L’insertion des multimères de PulD dans les liposomes a été vérifiée par : - leur coflottaison dans un gradient de sucrose - leur résistance à l’extraction par l’urée - la microscopie électronique → Les pores de sécrétines sont ouverts ou fermés in vitro ?

Conclusion générale PulD a la capacité spontanée de multimériser et de s’insérer dans une bicouche lipidique PulS empêche l’insertion spontanée des multimères de PulD dans la membrane interne La famille des sécrétines peut-être divisée en 2 sous-groupes : - Les sécrétines qui peuvent multimériser et s’insérer spontanément dans une membrane (PulD et OutD impliquées dans le TIISS) Les sécrétines qui nécessitent un ou plusieurs partenaires pour multimériser et s’insérer dans une membrane (PilQ impliquée dans les pili de type IV)

→ Pourquoi utilisation de la voie Lol ? En présence de PulS 5 : Multimérisation de PulD et insertion dans la membrane externe 4 : PulS se lie à LolB, libération de LolA 3 : Formation rapide d’un complexe PulD-PulS-LolA 2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC 1 : Synthèse dans le cytoplasme Membrane externe PulS PulD LolB 5 4 + LolA Périplasme PulS LolA PulD 3 Membrane interne 2 SEC PulD 1 → Pourquoi utilisation de la voie Lol ?

En absence de PulS 6 : Multimérisation de PulD Membrane externe LolB PulS PulD 5 4 + 6 : Multimérisation de PulD 7 : Insertion par défaut dans la membrane interne LolA Périplasme PulS LolA PulD 6 7 PulD 3 Membrane interne 2 SEC PulD 1

→ PulD a une voie de biogénèse différente des autres protéines intégrales de la membrane externe 5 : Multimérisation et insertion dans la membrane externe 4 : Prise en charge par le complexe Omp85 3 : Prise en charge par Skp et transport à travers le périplasme 2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC ou TAT 1 : Synthèse dans le cytoplasme Membrane externe Omp85 LolB PulS PulD 5 4 Skp + LolA Périplasme PulS LolA PulD Skp 3 Membrane interne 2 SEC 1

Localisation correcte de PulD « au dessus » du TIISS Membrane externe ? Périplasme PulG Membrane interne PulF PulE

Références Bayan N., Guilvout I., Pugsley A.P. - Secretins take shape 2006 Bitter W. – Secretins of Pseudomonas aruginosa : large holes in the outer membrane 2003 Filloux A. - The underlying mechanisms of type II protein secretion 2004 Büttner D., Bonas U. - Port of entry, the type III secretion translocon 2002 Chami M., Guilvout I., Gregorini M., Remigy H., Muller S.A., Valerio M., Engel A., Pugsley A.P., Bayan N. - Structural Insights into the Secretin PulD and Its Trypsin-resistant Core 2005 Cours de TAP 2007-2008 de S. Bleves et R. Voulhoux