Les phytochromes des bactéries photosynthétiques

INTRODUCTION Les phytochromes ont été découverts chez les plantes il y a environs 50 ans (S. Hendricks et H. Borthwick). Ils constituent une famille de chromoprotéines qui répondent à la lumière rouge/infrarouge.Ils existent sous deux formes absorbant soit lumière rouge soit la lumière infrarouge. Ces deux formes sont photoconvertibles de manière reversible. Les phytochromes ont un rôle de régulateur. En effet, le changement de forme provoque indirectement l’activation ou la répression de la transcription de gènes cibles. Ils interviennent dans la germination, la floraison, l’évitement de l’ombre, la forme et le nombre de feuilles, la synthèse de chlorophylle… Ce n’est qu’en 1997, que les phytochromes ont été découverts chez les Cyanobactéries (chez Synechocystis sp. PCC 6803 par Lampartner et al.) puis en 1999 chez différentes bactéries (chez les bactéries nonphotosynthetiques Deinococcus radiodurans et Pseudomonas aeruginosa par Davis et al., chez la bactérie pourpre photosynthetique Rhodospirillum centenum par Jiang et al).

Cyanobacteria Synechocystis sp. PCC6803 Anabaena sp. PCC7120 Nostoc punctiforme Prochlorococcus sp. MED4 1 2 a Proteobacteria Rhodobacter sphaeroides Rhodopseudomonas palustris Bradyrhizobium ORS 278 Agrobacterium tumefaciens Magnetospirillum magnetotacticum 6 3 Proteobacteria Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida KT2440 Pseudomonas syringae Deinococcus Deinococcus radiodurans

Longueur d’onde (nm) Absorbance Pr 660 nm Pfr 730 nm Deux formes interconvertibles : Une forme Pr (red) absorbant à 650 nm Une forme Pfr (far red) absorbant à 730 nm Phytochromes = apoprotéine (~ 1100 acides aminés ) + un chromophore (une biline = tetrapyrrole linéaire) responsable de la photoisomérisation. Homodimère de 120kDa. Chromoprotéines qui existent sous deux conformations. Une forme Pr qui absorbe la lumière rouge (650 nm) et une forme Pfr qui absorbe dans le rouge lointain (750 nm). Ces deux formes sont interconvertibles : lorsque la forme Pr absorbe de la lumière rouge, elle passe sous sa forme Pfr. LE changement de conformation est du à un changement de conformation du chromophore (la biliverdine). Une rotation autour de la liaison… Phytochromes = chromoprotéines existant sous deux formes : - Une forme Pr (r = red) absorbant à 650 nm - Une forme Pfr (fr = far red) absorbant à 730 nm Formes interconvertibles Domaines photorecepteur : 2 domaines GAF et PHY = signature des phyto Domaine regulateur : domaine de transduction du signal CBD C NH2 COOH Domaine photorécepteur Domaine régulateur

Biliverdine (bactéries) NADPH/O2 Hème oxygénase Biliverdine (bactéries) Phytochromobiline (plantes) Phycocyanobiline (cyanobactéries) réductase réductase

Site de fixation du chromophore : comparaison de différents phytochromes CysB (en N-ter) PAS/S-boxes Bradyrhizobium Br.Bph/724aa C CBD PAS/S-boxes R. palustris Rp.Bph1537/732 aa C Histidine kinase A. tumefaciens C At.BphP/745 aa Cys B BV en position 20 CysA (centrale) Histidine kinase Synechocystis C Cph1/748aa CBD PAS PAS Histidine kinase A. thaliana C phyB /1172 aa

C19 GAF PHY CBD PAS Rpa1537 I252H253 WT H253A C19S CSHA PM WT C19S H253A CSHA Fluorescence du chromophore biliverdine

Activation ou répression de la transcription de gènes cibles Lumière infrarouge O N COOH N Pfr Pr Lumière rouge Lumière rouge lointain Forme Pr Forme Pfr Kinase Kinase NH2 NH2 C COOH C COOH P CBD Syst à 2 composants largement decrits chez E. coli (chemotaxis), B. subtilis (sporulation) P Lumière rouge Lumière rouge P régulateur La photoisomérisation des phytochromes Activation ou répression de la transcription de gènes cibles

Transduction du signal par interaction protéine-protéine Lumière rouge lointain Forme Pr Forme Pfr Domaines PAS Domaines PAS NH2 COOH NH2 C COOH C CBD Lumière rouge Lumière rouge Interaction protéine- protéine Type de transduction jamais decrit auparavant pour un phyto. Activation ou répression de la transcription de gènes cibles

Wagner et al Nature Novembre 2005 vol 438,pp325-331

Photosynthèse CO2 H2O sels minéraux 1/2 O2 [CH2O] 2 H2O + énergie lumineuse 2 [H2] + O2 2 [H2] + CO2 [CH2O] + H2O sels minéraux 2 H2O + CO2 O2 + H2O + [CH2O] hu

Van Niel (1931) Végétaux, algues, micro-algues, cyanobactéries lumière 2 H2O + CO2 [CH2O] + H2O + O2 Bactéries photosynthétiques pour la plupart actives en condition anaérobie lumière 2 H2S + CO2 [CH2O] + H2O + 2 S 2H2 + CO2 [CH2O] + H2O

Rhodopseudomonas palustris Bactérie photosynthétique capable de se développer à l’obscurité (activité respiratoire) ou à la lumière (activité photosynthétique)

- ADP+Pi ATP  H+ DH C.R. + H+ _ Q Q Q + LHI LHII H+ ATPase Oxydases Cyt oxydase H+ DH C.R. cyt bc1 QH2 oxydase + H+ _ Q Q Q + - LHI LHII H+ cyt c2 ATPase cyt c2 photosynthèse respiration Oxydases O2+ 4e- + 4H+ 2H2O commun

- fluorescence  P+ C.R. + Qa- c2 P+ LHI LHII 542 nm cyt bc1 Les observables cyt c2

Condition anaérobie lumière B800-850 LH2 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 400 500 600 700 800 900 absorbance wavelength (nm) forte I LH1 B800 LH2 faible I

condition aérobie obscurité 1,2 B800-850 LH2 1 0,8 obs. 1% O2 LH1 absorbance 0,6 0,4 obs. 8% O2 0,2 400 500 600 700 800 900 wavelength (nm)

(Larimer et al., Nature Biotech. 2004) rpa0122 rpa0990 rpa1490 Ce séquença a révélé de façon exceptionnelle la présenc de 6 gènes codants des phyto putatifs. R pal apparaît comme étant l’organisme possédant le plus grand nombre de phyto identifiés à ce jour. 4 de ces bactériophyto sont retrouvés à proximité de gènes photosynthétiques,. rpa1537 rpa3016 rpa3015 (Larimer et al., Nature Biotech. 2004)

Environnement génomiques des six bactériophytochromes Gènes proches de gènes codant pour les polypeptides du centre rpa1537 réactionnel et l’antenne LH1 rpa0122 une succinate deshydrogénase rpa0990 une hydrogénase rpa1490 l e s p o l y p e p t i d e s d u B 8 - 8 5 LH2 rpa3015 l e s p o l y p e p t i d e s d u B 8 LH2 rpa3016

GAF PHY CBD HK Rpa3015 GAF PHY CBD HK Rpa3016 GAF PHY CBD HK Rpa0122 N D/F G C GAF PHY CBD HK Rpa3015 H N D/F G GAF PHY CBD HK Rpa3016 C H? N D/F G C GAF PHY CBD HK Rpa0122 H N? G C GAF PHY CBD HK (KWE) RR Rpa0990 N G ? GAF PHY HK ? CBD Rpa1490 C GAF PHY CBD PAS PAC Rpa1537

Expression in vivo des holobactériophytochromes pBAD/phyto+HmuO 6968 bp rpaBphy ampr araC hmuO Tag.His Pm.araBAD pUC ori not-induced induced La première étape a consisté à surproduire et à purifier ces bactériophyto pour cela un clonage des deux gènes correspondant a été réalisé dans le vecteur d’expression pBAD en présence du gène HmuO codant une hème oxygénase. Cette enzyme permet la synthèse du chromophore la biliverdine associé au phyto. Grâce à cette construction il est possible de surexprimer un phyto natif reconstitué in vivo et de purifier la protéine grâce à l’étiquette histidine rajoutée lors de la construction.

Rpa3015 Rpa3016 Rpa1053 Rpa1490 Rpa0990 Rpa1537

Rpa0990 Absorbance Wavelength (nm) 0,7 0,6 Pr 0,5 Pfr 0,4 0,3 0,2 0,1 300 400 500 600 700 800 Wavelength (nm)

Rpa0122 Absorbance Wavelength (nm) 0,6 Pr 0,5 Pfr 0,4 0,3 0,2 0,1 300 300 400 500 600 700 800 Wavelength (nm)

puf operon rpa1537 absorbance wavelength (nm) BA L M crtC crtE bchC bchY bchZ ppsR1 bch2 crtK PpsR2 HmuO crtD crtF bchX bchG bchP cycA 0,5 1 1,5 2 2,5 3 250 350 450 550 650 750 850 absorbance wavelength (nm) obscurité Pfr excitation 760 nm Pr

Spectre d’action de la synthèse de l’appareil photosynthétique 0,5 1 1,5 2 2,5 3 250 350 450 550 650 750 850 absorbance wavelength (nm) Pr Pfr

Spectre d’action de la synthèse de l’appareil photosynthétique wavelength (nm) 25 50 75 100 600 650 700 750 800 850 activity fluorescence fusion puf::lacZ fusion bchC::lacZ

souche sauvage obs. 660 nm 750 nm ∆rpa1537 750 nm

A : control B : + PpsR C : + PpsR bchCXYZ crtIB crtED DNA binding of PpsR on different promotor regions A : control B : + PpsR C : + PpsR bchCXYZ A B C crtIB crtED

Effet de la lumière sur la synthèse de l’appareil photosynthétique 100 WT ∆bphP cyt c2 photooxidation (nM) 50 ∆ppsR dark 740 nm

Rpa1537 détecte la présence de lumière, il active la synthèse des CRs et des complexes antennaires en levant la répression exercée par le facteur de transcription PpsR2 en condition semi-aérobie.

A l’obscurité en présence d’ O2 Pfr PpsR Bchl, puf gènes DNA A l’obscurité en présence d’ O2 A la lumière Pr PpsR synthèse de l’appareil photosynthétique

Fluorescence de la Bchl Transmission lumineuse Oxydation du TMPD

721 803 622 590 652 733 852 870 705 772 677 746 721 803 705 772 622 870 677 746 590 852 652 733

Effet de l’éclairement à 770 nm sous 8% d’oxygène Cultures liquides de : R. palustris CEA001 sauvage R. palustris CEA001 délétée pour un des phytochromes étudiés R. palustris CEA001 délétée pour un des régulateurs de transcription PpsR1 ou PspR2 Cultures en « photosynthetic medium », sous 8% d’oxygène, à l’obscurité ou éclairées à 770 nm (longueur d’onde correspondant aux spectres d’action de Rpa1537, Rpa0122 et Rpa0990) Expliquer le 8% d’oxygène

Effet de l’éclairement à 770 nm sous 8% d’oxygène 1 , 4 � � 1 , 2 1 Obscurité , 8 E c l a i r e m e n t � 7 7 n m Do (660nm) , 6 , 4 , 2 Bien dire pas de photosynthèse car les longueurs d’onde excitatrices de l’appareil photosynthétique absentes 1 2 3 4 5 T e m p s ( h ) Inhibition de croissance de 30% en moyenne pour les bactéries des cultures éclairées

Activité photosynthétique 2

Rpa1537 détecte la présence de lumière, il active la synthèse des CRs et des complexes antennaires en levant la répression exercée par le facteur de transcription PpsR2 en condition semi-aérobie. De plus Rpa1537 suprime partiellement l’activation de la synthèse de l’appareil respiratoire induite par PpsR2.

Rpa1490 ne fixe pas de chromophore B800-850 LH2 pucA.e pucB.e rpa1490 rpa1491 PpsR RR HTH Rpa1490 ne fixe pas de chromophore Rpa3015 Rpa3016 Rpa1053 Rpa1490 Rpa0990 Rpa1537

C Rpa 1490 MHSGLDNSAELRVSDFDPITLAGGTRTEV-LPGA Rpa 1537 MAGHASGSPAFGTADLSNCEREEIHLAGS Rpa 3015 MTEGSVARQPDLSTCDDEPIHIPGA Rpa 3016 MSSRSDPGQPMASATDPSGRLALDLTECDREPIHIPGA Rpa 0122 MDEADSGGIVTARNVDLSSCDREVQYPEA Rpa 0990 MPRKVDLTSCDREPIHIPGS C

Rpa1490 s’autophosphoryle sous sa forme réduite Phosphotransfert vers Rpa1491 L’état d’oligomérisation de Rpa1490 est redox sensible Rpa1490 Rpa1491 Natif +DTT +DTT +Rpa1491 Natif +FeCy +DTT +DTT+FeCy

WT dark 1% O2 ∆1490 dark 1% O2 absorbance wavelength (nm) 0,2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 400 500 600 700 800 900 absorbance wavelength (nm) WT dark 1% O2 ∆1490 dark 1% O2

Rpa1490 n’est pas un bactériophytochrome mais un senseur d’O2 impliqué dans la régulation de la synthèse des complexes B800-850LH2.

Rpa3015 et Rpa3016 taux de similarité : 67% B800LH2 rpa3018 rpa3017 pucA.d pucB.d rpa3015 rpa3016 B800LH2 taux de similarité : 67% REC Rpa3018 HK Rpa3017 Rpa3014 HTH Ces trois gènes codenttdes RR caractérisés par la présence d’ un domaine REC capable d’accepter un groupement phosphate au niveau d’un résidu d’aspartate. Par ailleurs Rpa3014 a la particularité de présenter en c-ter un domaine HTH, elle est donc susceptible de se fixer à l’Adn. On pourrait donc avoir dans cette région l’ensemble des éléments intervenant dans une chaine complète de transduction du signal lumineux.

Rpa3015 obs. exc. 705 nm Pr absorbance Pfr wavelength (nm) 0,4 0,35 0,25 0,25 absorbance 0,2 0,2 0,15 0,15 0,1 0,1 0,05 0,05 -0,05 250 350 450 550 650 750 850 wavelength (nm)

obs. exc. 705 nm exc. 645 nm Rpa3016 Pr absorbance Pnr for near red 0,7 0,7 obs. exc. 645 nm Pnr for near red exc. 705 nm Rpa3016 0,6 0,6 0,5 0,5 Pr 0,4 0,4 absorbance 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 -0,1 250 350 450 550 650 750 850 wavelength (nm)

Vitesses initiales Rpa3016 Pnr Pr Pr Pnr ∆A 400 nm Rpa3015 Pfr Pr B B J 10 B J B J Pnr Pr B J J B J B 5 J Pr Pnr J B B J ∆A 400 nm J B B J J J J J J J � E B E E E E E � E E E E � E E Rpa3015 � � -5 � � Pfr Pr � � -10 � � Pr Pfr � -15 -0,5 0,5 1 1,5 2 Time (s)

Rpa3015 et Rpa3016 s’autophosphorylent sous leur forme Pr 705 nm obs. obs. 705 nm P32 Rpa3015 et Rpa3016 s’autophosphorylent sous leur forme Pr 17% 100% 100% 55% Prot Rpa3014 + - - Rpa3018 - + - Rpa3017 - - + Rpa3015/3016 Phosphotransfert vers 2 réponses régulateurs Rpa3017 ou Rpa3018 Rpa3018 Rpa3014 Rpa3017

Contrôle des antennes de type B800LH2 par Rpa3015 et Rpa3016 0,5 1 1,5 2 2,5 3 550 600 650 700 750 800 850 900 A805/A860 longueur d’onde (nm) B B800LH2 A 751 nm absorption 712 nm 701 nm 677 nm 651 nm 637 nm 750 770 790 810 830 850 870 890 910 930 950 longueur d’onde (nm)

Rpa3016 and Rpa3015 détectent le rapport des intensités lumineuses entre 650 et 710 nm. Ils induisent la synthèse des complexes B800LH2 lorsque ce rapport est faible. Ils agissent peut être comme détecteurs de phytoplanctons.

Identification d’un nouveau bactériophytochrome chez Bradyrhizobium ORS278 gvpK gvpG gvpO gvpF gvpN gvpL gvpA 278.phyB3 phycocyanobiline oxydo reductase Heme oxygenase hemA

∆A.10-2 à 670 nm ∆A temps (s) micro mol photons/m2/s -2 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12 14 -4 ∆A.10-2 à 670 nm temps (s) B 0,5 1 1,5 100 200 300 400 500 600 700 800 ∆A micro mol photons/m2/s

Rpa3015 ∆A wavelength (nm) 2000 1500 1000 500 -500 1ms 8ms -1000 20ms B H H 1500 B B J J 1500 H B J B 1000 B F ∆A B J F J H F J H B 1000 500 B B H H H B B J J J H F B B B B B B F H B B F 500 -500 H J H B F J -100 100 200 H J H time (ms) J B J J ∆A B B B B H H J B B B B J B F J H J H F J B J B J J -500 H H H B B H J B F F B J J B B 1ms J H H B H H B F H F F H J B H H F B J J H B J B 8ms H B F J B -1000 J J J H 20ms J H B H F F J 50ms -1500 H B J H H 100ms B J F F J 200ms -2000 H B B H J F H J H 500ms -2500 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 wavelength (nm)

Rpa3016 ∆A wavelength (nm) 2000 1500 1000 500 1ms -500 8ms 20ms -1000 B B 1500 B 1000 ∆A B 500 B 1000 B J B B B B B B B J B -500 J 500 -100 100 200 H B time (ms) H H J B J ∆A F H J F H B J H J H B H J B H B J F H B J F F H B J H J B H H F F H H B H F B J J H B B H H F B J J H B J H B J F H B B J J F H B F B H B 1ms -500 B J H H F B J J H J B J J B H B J B J B J B F J 8ms H J H B J F F H 20ms J -1000 H B H J F 50ms H Rpa3016 F B 100ms H F J B H J B -1500 J 200ms H 500ms -2000 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 wavelength (nm)