Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique 19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR 6061 Luc.paillard@univ-rennes1.fr Modalités de contrôle post-transcriptionnel cytoplasmique

Que sont les régulations post-transcriptionnelles? AAAAAA AAAAAA

Que sont les régulations post-transcriptionnelles? (Régulation de la stabilité des protéines) Régulation de la traduction AAAAAA Régulation de la stabilité des ARNm AAAAAA Un niveau de contrôle de la concentration cellulaire en chaque protéine

« How is gene expression controlled in eukaryotes? As in prokaryotes, control is exerted primarily at the level of transcription » Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988

Importance du contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes Des altérations de facteurs de régulation post-transcriptionnelle provoquent des perturbations phénotypiques Importance du contrôle post-transcriptionnel chez les eucaryotes Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel

Des altérations de régulations post-transcriptionnelles provoquent des perturbations phénotypiques Mise en place de l’axe antéro-postérieur chez la drosophile

Des pathologies humaines sont associées à des défauts de contrôle post-transcriptionnel Thalassémies (a ou b) et instabilité des ARNm a ou b globine Oncogenèse et stabilisation d’ARNm de cytokines/proto-oncogènes

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm

Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines

Relations Transcriptome/traductome/Protéome Des approches systématiques d’estimation de l’ampleur des régulations post-transcriptionnelles? Transcriptome (puce, SAGE…) : niveau d’accumulation des ARNm Transcription, stabilité des ARNm « Traductome » (gradient) : Accumulation des ARNm dans les polysomes Traduction des ARNm Protéome (2DE, MS et dérivés) : niveau d’accumulation des protéines Traduction, stabilité des protéines Relations Transcriptome/traductome/Protéome

1. Levures en phase de croissance Marquage métabolique (Met-35S) des cellules Séparation des protéines par 2DE Quantification des spots, identification Niveaux d’expression de 106 protéines Gygi et al MCB 1999 19, 1720

1. Levures en phase de croissance Données de SAGE Niveaux d’expression des ARNm correspondants Gygi et al MCB 1999 19, 1720

1. Levures en phase de croissance Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines Gygi et al MCB 1999 19, 1720

1. Levures en phase de croissance Corrélation entre niveau d’expression des ARNm et des protéines Corrélation très mauvaise! Gygi et al MCB 1999 19, 1720

2. Réponse à un changement de milieu de culture Culture de levures en galactose Transfert en galactose ou éthanol Ratio Gal/Eth mesuré pour 245 produits de gènes : protéine (ICAT : MS en conditions quantitatives), ARNm (microarray) log du ratio des protéines=f(log du ratio des ARNm) (log=0 pour un produit de gène dont l’abondance ne change pas) Griffin et al MCP 2002 1, 323

2. Réponse à un changement de milieu de culture Griffin et al MCP 2002 1, 323

Conclusion Les régulations post-transcriptionnelles sont un niveau MAJEUR de régulation de l’expression génétique 2. (En conséquence, les analyses transcriptomiques peuvent être insuffisantes)

Bref survol des modalités de régulations post-transcriptionnelles Structure de l'ARNm eucaryote : AUG STOP 5' ORF AAA….AAA 3' 5'UTR 3'UTR Coiffe Queue poly(A) Régions non codantes

Rappels sur la traduction eucaryote Initiation Recrutement de la petite sous-unité ribosomique (40S) à l ’extrémité 5 ’ Scanning jusqu ’à la rencontre de l ’AUG initiateur Jonction de la grosse sous-unité (60S) = ribosome (80S) Elongation Lecture codon par codon Terminaison Relargage du peptide Le ribosome? Influence du contexte du codon stop

La 5’UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) 5’UTR de l’ARNm Gcn4 de levure : 4 uORF avant l’ATG initiateur Réinitiation possible « dans certaines conditions » en 3’ d’une uORF Ces conditions contrôlent la traduction de GCN4 Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453

La 5’UTR contrôle la traduction 1, Les uORF (upstream ORF) Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF, même chez les métazoaires Fonction???

La 5’UTR contrôle la traduction 2, Fixation d’une protéine dans la 5’UTR La fixation d’une protéine à proximité de la coiffe (<40nt) inhibe la traduction Exemple : Contrôle de la traduction de la ferritine par la séquence IRE et la protéine IRP

La 5’UTR contrôle la traduction 3, Les IRES (Internal Ribosome Entry Site) Initiation indépendante de la coiffe (et de eIF4E) Traduction de certains ARNm quand les autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire…)

La 3’UTR contrôle la stabilité 1, Le récepteur de la transferrine L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron Response Element) si la concentration cellulaire de fer libre est faible L’ARNm récepteur de la transferrine contient 5 IRE dans sa 5’UTR (et un site de clivage endonucléolytique) Complexe IRE-IRP : inhibition de dégradation Contrôle de la concentration intracellulaire en fer libre

La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Mise en évidence : 1986. ARNm de cytokines, proto-oncogènes… Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur sous contrôle d’un promoteur inductible Sans ARE Avec ARE Xu et al. MCB 2001 21, 6960

La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) 3 classes d’ARE Classe Exemple Description I c-fos, c-myc (AUUUA) répartis II GM-CSF, TNFa (AUUUA) chevauchants III c-jun Pas de (AUUUA)

La 3’UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U Rich Element) Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP) hnRNPD/AUF1, HuR, TTP… Effet positif ou négatif de la fixation de la protéine

La 3’UTR contrôle la stabilité 3, La queue poly(A) Un ARNm polyadénylé est généralement plus stable qu’un ARN désadénylé

La 3’UTR contrôle aussi la traduction 1, Les ARE (A/U Rich Element) Vecteur vide EGFP-ARE EGFP Transfection d’un plasmide codant un ARN EGFP (avec ou sans ARE dans la 3’UTR) Mesure de l’ARN (Northern) et de la protéine (western) EGFP Grosset et al. JBC 2004 279, 13254

La 3’UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) +/-cap Luciferase +/-poly(A) Incubation dans extrait de levure Même expérience en présence d ’anticorps anti PABP Mesure de luminescence Pas de stimulation de la traduction par la queue poly(A) Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997

La 3’UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue poly(A) +/-cap Luciferase +/-poly(A) Transfection dans les levures Mesure de luminescence "wt" Dpab1 La queue poly(A) stimule la traduction de façon dépendante de la PAB1 Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900

Mais tout cela est lié! Diminution de taille avant dégradation 1, ARE et état d’adénylation Cinétique de dégradation, en Northern, d’un ARNm rapporteur contenant un ARE sous contrôle d’un promoteur inductible Diminution de taille avant dégradation Peng et al. MCB 1996 16, 1490

+ - + Mais tout cela est lié! (et c’est encore pire…) 2, ARE, état d’adénylation, traduction, stabilité… + ARE-BP AUG STOP 5' ARE AAAA...AAAAA Ri - + (et c’est encore pire…)

La 3’ UTR contrôle la traduction ET la stabilité Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Et alors? miRNA RNAi siRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Mécanismes biochimiques Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

double brin par Argonaute! Biosynthèse des miRNA Reconnaissance d’un ARN double brin par Argonaute! Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez l’animal Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

Mise en évidence du RNAi Injection d'ARN sens, antisens ou double brin dans la gonade Phénotype de la descendance? Prix NOBEL 2006 Fire et al. (1998) Nature 391, 806

miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé) Environ 200 chez l’humain S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm Une 3’UTR peut être liée par plusieurs miRNA siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateur dans une cellule animale S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

Application en thérapeutique? Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionnel au service de l’expérimentateur Application en thérapeutique? Downward BMJ  2004 328, 1245