Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale Hôpital Purpan Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00

Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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MUTATIONS Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme). Variation de séquence héréditaire ou acquise Origines: - Spontanées (endogènes) (1): - Anomalies de la réplication de l ’ADN - les plus fréquentes (10-6 paires de bases par génération) - erreurs de l’ADN polymérase (erreur de lecture conduisant à des mésappariements ou mismatch) - favorisées par les séquences répétées - Accidents de recombinaison méiotique - surviennent lors de la méiose - favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes - délétions, duplications, recombinaisons illégitimes

Origines des mutations (suite): - Spontanées (2): - Déamination, en particulier de cytosine méthylée - très fréquent en pathologie humaine - non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN - ex: Arg CGA -> Stop TGA - Dépurination - Espèces oxygène réactives (ion O2- superoxide, radicaux libres) - Provoquées (extérieurs): - agents génotoxiques - 3 types: . chimiques (hydrocarbones, chimiothérapie), . physiques (radioactivité naturelle et autres rayons ionisants, UV) . biologiques (virus) - normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN - déficients dans certaines maladies génétiques (ex: xéroderma pigmentosum…)(cancers)

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Types de mutations A - Mutations ponctuelles B - Insertions ou délétions de plusieurs bases C - Expansions de triplets (mutations instables) D - Macrolésions

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A - Mutations ponctuelles Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques 1 - Substitutions de base Définition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène: - régions codantes: - mutation silencieuse - mutation faux-sens - changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe) ou non conservatrice - mutation non-sens - changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)

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1 - Substitutions de base (suite) - régions codantes: cas particuliers: - codon d ’initiation de la traduction - codon de terminaison de la traduction - séquences « Exonic splicing enhancer  » (-> anomalie d ’épissage) - mutation non-sens entraînant le saut de l ’exon correspondant (-> rétablissement de la phase)

1 - Substitutions de base (suite) - régions non codantes: - introns: - sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag) - sites non consensus d ’épissage - site de branchement - conséquences: -> saut d ’exon -> rétention d ’intron -> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique - séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription - séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm

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gt ag gt ag gt c Saut d ’exon gt ag gt gt ag gt a Activation d ’un site cryptique d ’épissage gt ag gt ag gt stop Saut d ’exon Exemples anomalies d ’épissage

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Conséquences possibles des mutations de la région 3’UTR Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

2 - Délétion ou insertion d ’une base - régions codantes: entraînent un décalage du cadre de lecture (« mutations décalantes ») conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions) Perte ou ajout de plusieurs bases - régions codantes: - Si multiple de 3: perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés - Si non multiple de 3 entraînent un décalage du cadre de lecture conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante 6081del28 6847del27

Conséquences des mutations Mutation respectant le cadre de lecture: - ex: . mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3, . anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la phase - conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant: - le remplacement d ’un acide aminé par un autre - la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés -> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises

Conséquences des mutations (suite) Mutation interrompant le cadre de lecture: - ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3 - conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner: - instabilité de l ’ARNm muté (NMRD) - synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité COOH anormale - synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence peptidique (saut d ’exon portant un PTC) -> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle

C - Expansions de triplets (mutations instables) - Répétitions instables de triplets nucléotidiques - Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables - Souvent maladies neuro-dégénératives - Le plus souvent transmission autosomique dominante - Exemples Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27 Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13 Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16 Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13

Mutations dynamiques (expansion de triplets) Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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D - Macrolésions - Conséquences délétères en pathologie et au cours de l ’évolution - Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb - Duplications - Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN (ex. translocation) - Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment d ’ADN)

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Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes (Maladie et gène connus +++) Analyse directe Mutation connue de petite taille de grande taille PCR - Enzyme de restriction - Hybridation spécifique d ’allèles - Séquençage +++ - Longue PCR ou - Southern-blot

Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage Père Arg->Stop CGA -> TGA Mère Arg->Stop CGA -> TGA EB Tropho

Analyse directe (1) Mutation inconnue PCR Détection: - SSCP Single strand conformational polymorphism - DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis - CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis - DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography Identification: - Séquençage +++

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Technique du SSCP Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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Principe des techniques du DGGE, CSGE et DHPLC Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Technique du DGGE Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Technique du DGGE Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC Pic d ’élution anormal Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

PCR multiplex Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Analyse directe (2) Macrolésions Cytogénétique Biologie moléculaire - Hybridation sur chromosome (FISH, Fluorescent in situ hybridization) - Southern-blot - PCR: Perte d ’hétérozygotie Défaut d ’amplification de l ’ADN

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Technique du Southern blot Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Analyse indirecte Etude de marqueurs génétiques polymorphes: - intra-géniques ou flanquant le gène - microsatellites ou bi-alléliques RFLP: Restriction fragment length polymorphism SNPs: single nucleotide polymorphism

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Etude de liaison génétique utilisant les marqueurs de COL7A1 PvuII D3S1581 D3S1568 D3S1588 54,62 Télomère Mb D3S3582 43,88 45 D3S3629 46,47-48,91 3p21 48,985 49,48 50 A Centromère Chromosome 3 Marqueurs génétiques Distance physique

219 221 Père 227 237 Mère Génotypage de marqueurs de COL7A1 219 237 Enfant atteint d ’EB récessive

219 221 Père atteint 227 237 Mère Génotypage de marqueurs de COL7A1 219 237 Enfant atteint d’ EB dominante familiale

Diagnostic prénatal d ’EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1) Père Mère Enfant EBDR Enfant sain Trophoblaste Porteur sain

Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques Sang Vérification des mutations ADN Génotypage (marqueurs de COL7A1) et Recherche de mutations de COL7A1 COL7A1 amplifié

Protéine qualitativement Exemples de conséquences des mutations Codons stop prématurés Mutations d’épissage Mutations faux-sens Instabilité ARNm Protéine qualitativement anormale Protéine non produite Stabilité variable Fonction anormale (diminution, perte ou nouvelle fonction) Allèle nul (perte de fonction) Maladies récessives Maladies dominantes (par haploinsuffisance) Maladies récessives Maladies dominantes (par effet dominant négatif)

Quelques définitions (1) Allèle: forme alternative au locus d’un gène Allèle nul: allèle qui ne produit pas de protéine Allèle hypomorphe: allèle qui produit une quantité réduite de la protéine ou une protéine moins active Allèle néomorphe: allèle dont le produit a une nouvelle activité Allèle antimorphe: allèle dont le produit antagonise l’activité du produit normal Disomie uniparentale: les deux copies d’un même chromosome viennent d’un seul parent Empreinte: expression différentielle et réversible d’un gène selon l’origine parentale Epigénétique: modifications de l’ADN sans altération de sa séquence (ex. méthylation de l’ADN, acétylation des histones) Epistasie: intéraction de plusieurs gènes pour produire un phénotype

Quelques définitions (2) Haploinsuffisance: le produit d’un seul allèle est actif, mais en quantité insuffisante pour une fonction normale Haplotype: groupes d’allèles transmis ensemble Hémizygote: présence d’un gène en une seule copie Hétérozygote: deux allèles différents d’un même gène Homozygote: deux allèles identiques d’un même gène Méthylation: addition d’un groupement méthyle (-CH3) à certains nucléotides (surtout la cytosine) interférant avec la transcription Microsatellites: séquence de un à 10 nucléotides répétés en tandem, souvent polymorphes Multifactoriel: résultant de l’interaction de facteurs environnementaux et génétiques multiples Transition: remplacement d’une purine (A, G) en l’autre, ou une pyrimidine (C, T) en l’autre Transversion: remplacement d’une purine (A, G) en une pyrimidine (C, T), ou d’une purine en une pyrimidine

Nomenclature des mutations Mutations faux-sens: ex: c.1784G>A ou p.Gly551Glu Mutations non-sens: ex: c.1626C>T ou p.Arg542X Mutations d ’épissage: ex SD: c.621+1G>A ex SA: c.622-2A>C Délétion : ex. en phase: c.1522_1524del ou p.Phe508del (« del » après 1er et dernier éléments délétés) Insertion: ex. décalante: c.409_410insC ou p.Glu137ProfsX17 (« ins » après les éléments encadrants l’insertion, suivi des nucléotides insérés) Insertion/délétion: ex: c.112_117delinsTG (ou c.112_117delAGGTCAinsTG) Génotypes: ex: [p.Phe508del] + [p.Gly551Glu] hétérozygote composite ex: [p.Phe508del] + [=] hétérozygote

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Mosaïcism Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Anomalies de l’empreinte parentale Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Maladies mitochondriales Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

Un gène = une maladie Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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