45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles 27-29 mai 2015 Apport d’une sonde fluorescente comme le Prodan pour caractériser la polarité des cuticules de feuilles Malgorzata Stawinoga, Mohamad Sleiman, Joeffrey Chastain, Claire Richard Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, UMR CNRS n°6296, Université Clermont Auvergne

Introduction La cuticule est un milieu complexe qui contrôle les échanges de composés chimiques entre la plante et le milieu extérieur-en particulier l’entrée des pesticides dans les plantes. Le transport des molécules à travers la cuticule est très étudié en revanche le développement d’outils pour approfondir la connaissance du milieu est moins documenté dans la littérature. La fluorescence est souvent utilisée pour étudier les interactions cuticules-composés chimiques: distribution de produits fluorescents ou suivre l’entrée de composés spécifiques. Visualisation du phénanthrène dans des cuticules (Li et al, EST 2014) Variété de sondes fluorescentes pour différentes applications par exemple des molécules qui deviennent fluorescentes après réaction avec des espèces activées de l’oxygène ou des molécules dont la réponse spectrale est fonction du milieu. 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Objectif: Mettre au point une méthode simple pour estimer la polarité de cuticules Composition variable en fonction de l’espèce du stage de développement Cire extracuticulaire Cutine + cire intracuticulaire Grand nombre de constituants Cires: alcools, alcanes, acides, esters, aldéhydes C20-C40 Cutine: polymère dont les principaux monomères sont des acides dihydroxy et epoxy C16 et C18 cellules Estimer la polarité moyenne de ces milieux en utilisant une sonde adaptée: Prodan 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Prodan, sonde fluorescente lA = 340 nm lE = 390-540 nm Polarité croissante du solvant Dl = 150 nm Augmentation calculée du moment dipolaire trop petite pour expliquer de tels déplacements.  Les interactions de type liaisons hydrogène jouent aussi probablement un rôle.  obsvd em =25.2  0. − 2.6  0.2 ∗ − 2.5  0.2  −(1.0  0.1) n (cm-1) =107/l (nm) polarité capacité donneur H capacité accepteur H (10-3 cm-1) Moyano, J Phys Chem 2006 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Etapes- difficultés à gérer Choisir des cuticules, les extraire et les préparer Suffisamment transparentes pour permettre l’absorption du Prodan et la mesure  Cuticule d’une plante grasse, cuticule de peau de grain de raisin, poivron vert Imprégner les cuticules avec le Prodan- vérifier qu’il est « dissous » dans la cuticule et non sous forme cristallisée.  tests Enregistrer les spectres. Milieu solide = non homogène  nombreuses répétitions des mesures 340 nm Interpréter les données. Pas ou peu de données sur les composés à longues chaînes, solides à température ambiante  à partir des valeurs connues pour les solvants usuels, on a fait des extrapolations et établi des corrélations pour les composés à longues chaînes 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Préparation des échantillons solides 2. Le Prodan est solubilisé à chaud dans des cires: Paraffine (alcanes C20-C30) Docosanol (C22) CH3-(CH2)20-CH2OH 1. Le Prodan est déposé : - sur du quartz - sur des filtres C18 3. Le Prodan est mis à imprégner - dans des films de polyéthylène -(CH2-CH2)n- - dans des cuticules 24h puis rinçage 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Fluorescence du Prodan/différents supports et PE Prodan cristallisé sur quartz lem = 425 nm Interactions Prodan-Prodan Prodan sur silice C18 lem = 500 nm Interactions Prodan-HO-Si Prodan dans le polyéthylène lem = 395 nm Microscopie de fluorescence des films de PE 100 m Dosage quantitatif dans PE 100 m Par UV, films de 50 mm d’épaisseur, concentration de 2x10-3 M 1,25 mg par cm2 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Fluorescence du Prodan/différents milieux solides Alcools linéaires R2 = 0,991 = 163.6nc + 19900 Wavenumber (n/1000 cm-1) Paraffine+docosanol Alcools linéaires 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Emission du Prodan dans les cuticules 423 436 448 max (nm) 10 m 100 m Zamifulia: films de 19 mm d’épaisseur, 0,48 mg par cm2 Poivron vert: films de 59 mm d’épaisseur, 3,8 mg par cm2 PE: films de 50 mm d’épaisseur, 1,25 mg par cm2 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Extraction et caractérisation UV des cuticules Cuticules extraites de Spectres de transmission UV-visible mesurés sur d’un Cary 300 équipé d’une sphère d’intégration - Feuilles de Zamioculcas zamiifolia - Peaux de raisin blanc - Peaux de poivron vert Extraction par congélation et au scalpel, Nettoyage à l’eau et à l’alcool Echantillons suffisamment transparents pour permettre l’absorption de lumière UV par le Prodan et la détection de la fluorescence 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Emission du Prodan dans les cuticules Alcools linéaires Alcools en C14-C18 Alcools en C22-C24, acides en C20 Alcanes, esters ou acides à très longues chaines Cutine: acide 10,16-dihydroxyhexadecanoïque 10 m 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015

Conclusions Par la technique d’imprégnation utilisée, on réussit à dissoudre le Prodan dans la cuticule et les émissions observées sont indicatives des caractéristiques chimiques des différentes cuticules testées. Les spectres d’émission sont larges, en accord avec une dispersion du Prodan dans différentes zones – à propriétés chimiques différentes (polarité, donneur ou accepteur H). Le travail réalisé a également permis d’établir des relations entre la fréquence maximale d’émission et le nombre de carbones pour les alcools linéaires. Ceci permet de pallier au manque de données sur les propriétés de polarisabilité et de donneur ou accepteur H des composés à longues chaînes solides à température ambiante. 10 m 45ème Congrès du Groupe Français des Pesticides, Versailles, 27-29 mai 2015