L’EXPRESSION DES MARQUEURS PRO-INFLAMMATOIRES ET LES FACTEURS DE RISQUE DU CANCER DU SEIN Je vous presente des resultats de mon projet de doctorat portant sur l’association entre Mirette Hanna, Michèle Orain, Simon Jacob, Bernard Têtu et Caroline Diorio Mirette Hanna MD- Pathologie clinique et banque de sang MSc- Pathologie clinique et chimique PhD (candidate)- Médecine expérimentale

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Inflammation et cancer du sein Introduction Inflammation et cancer du sein Rudolph Virchow

Inflammation et cancer du sein Introduction Inflammation et cancer du sein Inflammation chronique de bas grade Rôle dans la tumorigenèse Marqueurs anti-inflammatoires Facteurs génétiques = polymorphismes des gènes codant les cytokines Irritants chimiques et physiques (rayons UV)- infection non-resolue Inflammation chronique induit le développement du cancer du sein Inflammation chronique manifeste par un déséquilibre entre l’exp des marqueurs pro- et anti-inflammatoires avec une une surexpression des marqueurs pro-inflmmatoire dans le t. mammaire Marqueurs pro-inflammatoires

Inflammation chronique de bas grade Une inflmmation induite par des (mutagenes ) facteurs genetiques ou environmentaux a causer la surexperssion des markers pro-inflammatoires tels que IL-6 et le TNF ainsi que d’autres . Ceux ci vont induire une proliferation cellulaires, l’angiogenese causer un dommage a l’AND et + la syntheses d’estrogen dans le t. mammaire Creant anici un microenvironement favorable au development d’un cancer IL-6= Interleukine-6 TNF-α= Facteur de nécrose tumorale-α (http://www.hindawi.com)

Hypothèse Mutagènes Inflammation locale Facteurs de risque du cancer du sein Génétiques Environnementaux Interleukine-6 (IL-6) Facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) Risque du cancer du sein Radiologique Densité mammaire Microenvironnement mammaire Prolifération cellulaire soutenue ADN endommagé Synthèse d’estrogène Suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale Histologique Involution lobulaire La surexpression d’il-6 et TNF ds le t mammaire va affeter les facteurs de risque du cs (DM et IL) et par consequent augment le risque de developer un cs Les muatagens inducent (causent) une inflammation local dans le tissue mammaire Ki se manifaissete par une augmentaion dans l’expression des marqueurs iinflammatoires dans les mammaire cellules epitheliales se refleter sur les facteurs de risque du CS et detecter radilogiquement (augmentation de DM) et /ou histologiquement (diminution de l’involution lobulaire) 6

Facteurs de risque du cancer du sein Densité mammaire 0% 11% 41% 64% 90% La DM represente la proportion du sein occupe par du t fibroglandulaire dense Apparait blanc sur une mammographie Donc plus il ya des zones blanches sur une mammaographie plus le sein est dense plus la femme est a risque de developper un CS Les seins les plus dense sont 3-5 X plus a risque de developer un CS La proportion du sein occupée par du tissu fibroglandulaire dense Positivement associée au risque du cancer du sein Hanna & Diorio, Climacteric 2013, 16:407-416

Facteurs de risque du cancer du sein Involution lobulaire Épithélium Stroma Tissu adipeux Acini/lobule Sein non involué Sein involué IL atrophie physiologique du sein Si on prend la Dans la photo à droite (sein involué) et on la compare a la photo a gauche Reduction tu tissufibroglandulaire Aug du t. adipeux Moins lobules Des lobules deviens de tailles plus petits Peu d’acini par lobule Comparer à la photo à gauche (sein non involué) Atrophie physiologique du sein Inversement associée au risque du cancer du sein Milanese et al., J Natl Cancer Inst 2006, 98:1600-1607

Objectif Mutagènes Inflammation locale Facteurs de risque du cancer du sein Génétiques Environnementaux Interleukine-6 (IL-6) Facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) Risque du cancer du sein Radiologique Densité mammaire Microenvironnement mammaire Prolifération cellulaire soutenue ADN endommagé Synthèse d’estrogène Suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale Histologique Involution lobulaire Association entre l’expression de l”IL-6 et du TNF ds le tissue mammaire normal avec la DM ainsi que l’IL Évaluer l’association entre l’expression des marqueurs pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) dans l’épithélium normal et la densité mammaire Évaluer l’association entre l’expression des marqueurs pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) dans l’épithélium normal et l’involution lobulaire

164 femmes (82 pré- et 82 post-ménopausées) Méthodes Population de l’étude 164 femmes (82 pré- et 82 post-ménopausées) Critères d’inclusion Cancer du sein <70 ans Mammographie Pas de chimiothérapie ni radiothérapie néo-adjuvante Pas de chirurgie mammaire autre (réduction – pose d’implant) Pas d’autre cancer Pas enceinte au moment du diagnostic Notre pop d l’étude est forme de 164 50 femmes diagnostiquees par un CS et agees de moins de 70 ans Pour qu’une femme soit admissible elle doit Avoir un cancer du sein Être âgée de moins de 70 ans Avoir eu une mammographie durant les 6 moins précédent son diagnostic N’a pas reçu de la chimio ou de la radiothérapie comme traitement adjuvant N’a jamais subi des chirurgies mammaires (soit augmentation ou réduction mammaire ou chirurgie pour masse) N’a pas d’histoire d’un cancer autre que le carcinome basocellulaire de la peau N’est pas présentement en état de grossesse

Mesure des marqueurs pro-inflammatoires Construction de micromatrices tissulaires (TMA) 6 carottes (1mm de diamètre) de tissu normal / patiente (Beecher Instruments®Tissue Microarray Technology, Estigen, Sun Prairie, WI, USA) Tissus témoins (MCF-7, MDA-231 et SKBR-3) Coupes en séries (4 microns) Coloration par H&E et immunohistochimie pour mesurer l’expression des marqueurs inflammatoires on a construit des micro TMA Pour chaque f 6 carottes situes au moins a 1 cm de la tumeur sont extrait des blocs de mastectomies et places d’une facon aleatoires sur des blocs de parafin vierge (De facon que chaque f soit representer 2 fois sur chaque TMA) Pour control de qualite ont a place des linees cellulaires temoins +ve ds chauqe TMA Des coupes en series colorees et numerisees La coloration par H&E pour examiner lhistologie et confirmer la presence de epith normal ds la carotte Les lames colorees par IHC serre a evaluer l’express des marqueurs H&E IHC Contrôles positifs et négatifs pour chaque cycle de coloration Numérisation des lames colorées (NanoZoomer 2.0HT, Hamamatsu) TMA = Tissue microarray H&E = Hematoxylin-eosin (www.spingerimages.com) 11

Intensité de l’immunomarquage Évaluation de l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans l’épithélium mammaire normal Intensité de l’immunomarquage IL-6 (IL6 (1): sc-130326; Santa Cruz Biotechnology) TNF-α (TNF-α (52B83); Santa Cruz Biotechnology) Evaluer l’ IM en cat 4 selon l’intensite d’expression Puis on a regroupe toutes les f en deux cat Soit des f positives (quelque soit l’intensite d’IM) vs des f –ve pour le marqueur Entre 1-6 carottes / patiente= mediane 0 1+ 2+ 3+ Négatif Positif

Étendue de l’immunomarquage Évaluation de l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans l’épithélium mammaire normal Étendue de l’immunomarquage 0% 1-9% 10-50% >50% Proportion de cellules épithéliales positives pour IL-6 (IL6 (1): sc-130326; Santa Cruz Biotechnology)

Méthode assistée par ordinateur Mesure du pourcentage de densité mammaire Méthode assistée par ordinateur Sein non affecté La DM sera mesurée par une méthode assisté par ordinateur sur des images de mammographie numérisées sur une echelle en continue par un seul observateur aveuglé des information des patientes Puis le nombre de pixels dans la totalité du sein et le nombre de pixel dans la région dense du sein seront calculés La proportion entre les 2 x par 100 représentera le pourcentage de DM women with the highest mammographic density have 3-5 fold greater risk of developing breast cancer compared to women with the lowest mammographic density when mammographic density is measured with either method 0% 11% 41% 64% 90% nombre de pixels dans la région dense du sein nombre de pixels dans la totalité du sein Pourcentage de densité mammaire = X 100

Mesure de l’involution lobulaire Degré d’involution lobulaire Involution complète (≥75% TDLUs involués) Involution partielle (1-74% TDLUs involués) Pas d’involution (0% TDLUs involués) Type de lobule dominant (≥60% du nombre total des lobules) 2 mesures de lIL ont été evaluer sur des lames de coupes completes coloree H&E -Le degre dIL est evaluer ont 2 cat Des seins completement invilues vs des seins non ou partelliement involues ( selon le % de lobules involue) -id le type de lobule dominant Soit le type 1 (contient < 12 acini) qui normalement predominent dans les seins involues Vs les autres types (qui contienent plus d’acini Type 1 (<12 acini) Type 2 (12-79 acini) Type 3 (≥80 acini) TDLUs = Terminal ductal lobular units

Analyses statistiques Modèles linéaires généralisés Ajustement pour les facteurs potentiellement confondants L’a ssociation est mesure par des modeles lineaires generalises ajustees pour les facteurs confondant

Caractéristiques des participantes à l’étude Résultats Caractéristiques des participantes à l’étude Caractéristique Moyenne   ET Âge à la chirurgie (ans) 52,57 (7,85) Indice de masse corporelle (Kg/m2) 27,04 (5,67) Tour de taille (cm) 86,93 (12,67) Âge au premier enfant 25,86 (4,14) Consommation d'alcool (verre/semaine) 4,32 (4,61) Pourcentage de densité mammaire 22,50 (14,71) N (%) Statut de ménopause, femmes post-ménopausées 82 (50,00) Parité 119 (72,56) Allaitement 62 (37,80) Contraceptifs oraux 157 (95,73) Hormones de remplacement 55 (33,54) Niveau collégial ou universitaire complété 99 (60,37) Histoire familiale de cancer du sein 34 (20,73) Fumeur 95 (57,93) Degré d'involution lobulaire Pas ou partiellement involué 77 (46,95) Complètement involué 87 (53,05) Type de lobule dominant Type 1 dominant et pas de lobule de type 3 68 (41,46) Pas de lobule de type 1 ou mixte 96 (58,54) Juste a maintenir que les femmes etaient agees entre 30-et 69 ans avec une moyennes de 52 ans ET = écart-type

Association entre l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans l’épithélium mammaire normal et le pourcentage de densité mammaire p =0,0008* p =0,0006* IL-6 TNF-α p =0,2596* p =0,2223* Une asso positive sig entre l’exp d’IL –e (en intensite et %) et le % de DM mais le TNF On stratifiant nos analyses par le status de menopause , on avait une association +ve pour le 2 marqueurs chez les f. premenop *Résultats ajustés pour l’âge à la mammographie et le tour de taille Résultats significatifs pour IL-6 et TNF-α chez les femmes pré-ménopausées

Association entre l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans l’épithélium mammaire normal et le degré d’involution lobulaire IL-6 p =0,0058* p =0,0022* TNF-α p =0,0023* p =0,0022* Par contre L’expr des 2 marqueurs etait –vement associeau degree d’IL chez toutes les f ainsi que ches les f premenopausees *Résultats ajustés pour l’âge à la chirurgie Résultats significatifs pour IL-6 et TNF-α chez les femmes pré-ménopausées IC= Intervalle de confiance

Association entre l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans l’épithélium mammaire normal et le type de lobule dominant IL-6 p =0,9091* p =0,9448* TNF-α p =0,4445* p =0,5418* Cependant l’exp des markers n’etait pas associe au type de lobue dominant *Résultats ajustés pour l’âge à la chirurgie IC= Intervalle de confiance

Conclusions et perspectives Une augmentation de l’expression d’IL-6 et du TNF-α dans l’épithélium normal est associée à une augmentation de la densité mammaire et à une réduction de l’involution lobulaire. Les marqueurs pro-inflammatoires affectent la carcinogénèse mammaire via possiblement leurs effets sur la densité mammaire et l’involution lobulaire Réduire l’expression des marqueurs pro-inflammatoires dans le tissu mammaire pourrait être un outil prometteur pour modifier les facteurs de risque du cancer du sein et par conséquent en réduire l’incidence. Une sur expression d ‘IL-6 et du TNF aug est asso a une aug du DM ainsi que reduction de IL et par consequent une aug du risuqe du CS Il serait utiles d’etudier les facteurs qui influencer l’expr des marqueurs inflammatoires ds le t. mammaire comme et pour les utiliser comme utiles pour dimminuer le risque du CS

Remerciements Ce projet a été financé par l’Alliance Canadienne pour la Recherche sur le Cancer du Sein Je tiens à remercier Merci

(Yu et al, 2009)

Mesures de densité mammaire Qualitative Quantitative Wolfe Tabar BI-RADS Estimation visuelle Méthode assistée par ordinateur

Mesures de densité mammaire Qualitative 1. Catégories de Wolfe N = sein graisseux P1 = graisseux + canaux < 25% du volume du sein P2 = canaux > 25% du volume du sein DY = dysplasie – canaux 2. Classification de Tabar DY peu de dysplasie Beaucoup de dysplasie 3. Catégories de BI-RADS Wolfe: 4 catégories basées sur l’estimation visuelle de l’ampleur de la DM sur une mammographie C’est 4 catégories corrélées avec un risque accru du cancer du sein 1 = non dense; 2 = peu dense, 3 = modérément dense; 4 = peu dense. BIRADS = Breast Imaging Reporting and Data System

Mesures de densité mammaire (suite) Quantitative 4. Estimation visuelle Proportion de tissu dense aperçue 5. Méthode assistée par ordinateur 0% <10% <25% <50% <75% ≥75%

Marquages des marqueurs inflammatoires CRP Cytoplasmique IL-6 TNF-α IL-8 COX-2 SAA-1 STAT 3 Nucléaire LEP TGF-b IL-10 LF CRP = protéine réactive C; IL-6 = interleukine 6; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha; IL-8 = interleukine 8; COX-2 = cyclooxygénase 2; SAA-1 = sérum amyloïde A 1; STAT3 = transducteur de signal et activateur de transcription 3; LEP = leptine; TGF-b = facteur de croissance transformant beta; IL-10 = interleukine 10 et LF = lactoferrine

Facteurs de risque du cancer du sein Augment Réduit Âge Histoire familiale de cancer du sein DRCA1 et BRCA2 mutation Radiation Maladies bénignes du cancer du sein Ménopause tardive Ménarche précoce Pas d’enfant Densité mammaire Hormones Obésité (post-ménopause) Alcool IGF-1 Contraceptifs Parité Allaitement Activité physique Obésité (pré-ménopause) Anti-inflammatoires

Marqueurs inflammatoires et densité mammaire Étude Marqueur Densité mammaire Population Résultats Yang, 2010 COX-2 (tissu) BI-RADS Post-ménopausées ↑ COX-2 → ↑ densité mammaire Reeves, 2011 CRP IL-6 TNF-α (sérum) Méthode assistée par ordinateur Post-ménopausée ↓ CRP, ↓ IL-6 → ↑ densité mammaire ↓ TNF-α Perdue après ajustement Maskarinec, 2010 LEP Pré-ménopausée ↓ LEP → ↑ densité mammaire McCormac, 2009 Stuedal, 2006 COX-2 = cyclooxygénase 2; CRP = protéine réactive C; IL-6 = interleukine 6;TNF-α =facteur de nécrose tumorale alpha; LEP= leptine

H-score H-score = (% des cellules négative X 0) + (% des cellules de faible intensité X 1) (% des cellules d’intensité modérée X 2) (% des cellules de forte intensité X 3) = 0-300 (Ishibashi, 2003)

Carotte IL-6 TNF-α 5 4 1 27 23 2 25 28 3 44 41 31 34 6 7 11