DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie CONFERENZA DI LANCIO, 24 MARZO 2014 UTILISATION DE L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE POUR L’ASSAINISSEMENT VIRAL DE LA VIGNE BADRA BOUAMAMA-GZARA 1, ILHEM SELMI 2, HAMZA BEN MOHAMED, SAMIR CHEBIL 1 NAIMA MAHFOUDHI 2 1 : LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE MOLÉCULAIRE DES PLANTES,CENTRE DE BIOTECHNOLOGIE DE BORJ-CEDRIA 2: LABORATOIRE DE VIROLOGIE, INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE AGRONOMIQUE DE TUNISIE

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie INTÉRÊT DE LA CULTURE DE LA VIGNE EN TUNISIE Bidh Hamem RafRafBalta 1 El Biodh Razegui Khamri 2 Kahli Kerkennah Muscat RafRaf Marsaoui Sakasly Meski Tozeur Tounsi Tounsi Kerkennah

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie PROBLÉMATIQUE: TOUTES LES VIGNES AUTOCHTONES SONT INFECTÉES PAR LES VIRUS Mahfoudhi et al., 2014 (Tun. J. Plant Protection) GFLV, GFkV, GLaV1, 2, 3 Martelli, 2014 (J. Plant Pathology), Mahfoudhi et al., 1998 GVA, GVB, GRSPaV Mahfoudhi et al., 2014 (J. Plant Pathology) GVD

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie TECHNIQUES D’ASSAINISSEMENT CHEZ LA VIGNE TechniquesGénotypesVirus Taux de réussite Auteurs Embryogenèse somatique Müller-Thurgau Grignolino Bosco GVA GRSPaV GLRaV-1, % Gambino et al., 2006 Cryothérapie /culture d’apex électrothérapie /Culture d’apex BlackGVA 62% 40% Bayati et al., 2011 Thermothérapie in vitro/ culture d’apex Mantilaria Prevezaniko GLRaV-Pr GRSPaV 39.6%-92.45% Malioga et al., 2009 Chimiothérapie 2 variétés roumaines GFkV 100% Guta et al., 2014 Culture de méristème Thermothérapie in vivo/c. méristèmes Thermothérapie in vitro/ c. méristèmes Embryogenèse somatique 26 variétésGRSPaV 28.9% 23.6% 9.1% 100% Gribaudo et al., 2006 Thermothérapie in vivo Rèze 141 GLRaV-1 GVA GRSPaV 75% 43% 95% Reynard et Spring, 2013 Embryogenèse somatique Roobernet Rupestris du Lot GLRaV-1 GFLV 100% Goussard et al., 1991

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie QU’EST CE QUE L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE? cellule différenciée Cellule dédifférenciée Formation des embryons somatiques Perception du signal (paroi) Transduction du signal Remodelage de la chromatine Activation de gènes (SERK, LEA, deshy., division cel., maturation, protoderme, Fact transc. phyt.end) Acquisition de la polarité Formation du protoderme Développement des embryons somatiques Germination en somaplants pH, ca++, obscurité, temp. froid, blessure, phytohormones, source carboné Cellule embryogène

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie QUELLE EST L’UTILITÉ L’EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE? ∞ Intégration dans des programmes d’amélioration (tests clonaux ……) ∞ Programmes de transformation génétique ∞Induction de la variation somaclonale (variabilité génétique) ∞Extraction de métabolites secondaires (bioréacteurs) ∞ Éradication de virus

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ETUDE DES POTENTIALITÉS EMBRYOGÈNES CHEZ HUIT VARIÉTÉS DE VIGNE VARIÉTÉS ITALIENNES 1. INZOLIA 2. CATARRATO 3. ZIBIBBO 4. NERO D’AVALO VARIÉTÉS TUNISIENNES: 1. MUSCAT RAF-RAF 2. BELDI 3. KHAMRI 4. GUELB SERDOUK

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie CULTURE IN VITRO: MÉTHODOLOGIE EXPLANTS INFLORESCENTIELS: FLEURS ENTIÈRES ANTHÈRES STIGMATES OVAIRES OF Cap E Milieux utilisés: VV16: MS +88 mM saccharose + 5 µMNOA+ 4.4 µMBAP VV12: MS +88 mM saccharose + 10 µMNOA+ 4.4 µMBAP

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie RÉPONSES DES EXPLANTS INFLORESCENTIELS: VISUALISATION MORPHOLOGIQUE Cas des anthères Cas des ovaires Cas des inflorescences Cas des stigmates

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie EXPRESSION DES EMBRYONS SOMATIQUES Maturation des embryons somatiques: Globulaire Cordiforme Torpille Cotylédonaire

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie GERMINATION DES EMBRYONS SOMATIQUES Élongation Enracinement Développement des feuilles cotylédonaires

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ASSAINISSEMENT D’UNE VARIÉTÉ DE VIGNE LOCALE ‘HENCHA’ Évaluation de l’état virologique Régénération via l’embryogenèse somatique Evaluation de l’état sanitaire des somaplants

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ÉTAT VIROLOGIQUE DE LA VARIÉTÉ ‘HENCHA’ Test sérologiques: Boutures lignifiées DAS-ELISA (GLRa-V-1, 2, 3) (GFLV) (ArMV) (GFkV) TAS-ELISA GVA GVB RESULTATS Double infection virale: GVA, GFkV Extrait végétal

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ANALYSE MOLÉCULAIRE DE LA PLANTE MÈRE: RT-PCR Acides nucléiques totaux (TNA) Extraction: phloème (boutures lignifiées) Tampon guanidine (Foissac et al., 2001) RT-PCR: GVA, GRSPaV, GFkV Triple infection de la plante mère ‘Hencha’ RSP-H48: AGCTGGGATTATAAGGGAGGT RSP-C49: CCAGCCGTTCCACCACTAAT Lima et al., 2006 GRSPaV: 329 pb Minarfa et Hadidi GVA: 430 pb H587 (5´- GACAAATGGCACACTACG-3´) C995 (5´-AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG-3´) Présence du GSPaV Présence du GVA

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie RÉGÉNÉRATION D’UNE VARIÉTÉ DE VIGNE DE TABLE ‘HENCHA’ Bouturage fructifère ou forçage

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie EMBRYOGENÈSE SOMATIQUE À PARTIR DU FILAMENT CP4: Chée and Pool (1987)+ 2 mg/l 2,4-D+2.5 mg/l TDZ Matériel: Anthères immatures (stade H, Baggiollini)

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie VISUALISATION DES EMBRYONS SOMATIQUES PAR ESEM Embryons somatiques primaires issus de façon directe à partir du point d’attachement du filament

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie EXPRESSION DES EMBRYONS SOMATIQUES CHEZ LA VARIÉTÉ HENCHA

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie CONVERSION DES EMBRYONS SOMATIQUES EN SOMAPLANTS 1. Embryogenèse somatique seule: (sans traitement préalable). 2. Couplage (embryogenèse somatique/ thermothérapie in vitro):Traitement de 15 somaplants par un choc thermique in vitro (39°C/48h). Deux traitements:

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie LAVAGE DES SOMAPLANTS AVANT L’ACCLIMATATION

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie TRANSFERT DES SOMAPLANTS EN POTS

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie SOMAPLANTS APRÈS UN MOIS D’ACCLIMATATION Taux de reprise de 80%

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie CONSERVATION DES SOMAPLANTS DANS DES PHYTOTRONS

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ACCLIMATATION

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie ANALYSE DE 50 SOMAPLANTS ISSUS DE LA VARIÉTÉ ‘HENCHA’ Extraction du TNA tampon guanidine thiocynate (Foissac et al., 2001) Nervures principales issues de boutures herbacées ( 6 mois d’acclimatation) RT-PCR GRSPaV GVA GFkV en cours de réalisation

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie RÉSULTATS 100% des somaplants indemnes des virus GVA et GRSPaV 100% des somaplants issus embryogenèse couplées à la thermothérapie in vitro indemnes des virus GVA et GRSPaV

DIVIN est un projet cofinancé par le Programme de Coopération Transfrontalière Italie-Tunisie PERSPECTIVES Confirmer l’absence des particules virales au niveau des différents stades de développement de l’embryogenèse somatique par une étude ultrastructurale (TEM) Multiplication des têtes de clones assainis de la triple infection Évaluation de la conformité des somaplants (RAPD/ cyto. Flux, amélographie) Évaluer l’état sanitaire des somaplants issus des 8 variétés étudiées dans le cadre du projet