Les cellules endothéliales circulantes et leurs progéniteurs Master 1 2015-2016 Dr GUILLET Benoît Unité d’Hémostase bioclinique (UHBIC), CHU Rennes Université Rennes 1

L’endothélium Une monocouche simple de cellules tapissant la face interne des vaiseaux Cellules  1 à 6 x 1013 Poids total  1 kg Surface totale  1 à 7 m² Forme une interface mutable dynamiquement, répondant localement aux stimuli environnementaux

Différentes sous-populations de cellules endotheliales Moelle osseuse Progéniteurs des cellules endothéliales (PCE) Mur vasculaire Cellules endotheliales (CE) Cellules endothéliales sanguines circulantes Progéniteurs Matures (PCE) (CEC) Mobilization Détachement REGENERATION LESION

Cellules Circulantes Endotheliales 1970: Des critères cytologiques et morphologiques « Cellules non hématopoïétiques d’origine endotheliale possible » Cellules nuclées intactes de grande taille Diamètre : 15 à 50 micron Bouvier et al, Thromb Diath Haemost,1970, 1990 : Aux technologies actuelles pour la détection des évènements rares “CEC immunologiquement définies” S Endo 1 (CD 146) George et al, 1991 CBL-HEC Sbarbati et al, 1991 P1H12 Solovey et al, 1997 Com-7A4, Com-2D6 unpublished (www.biocytex.fr)

Détection d’évènements rares : la place des CEC Nucleated Red Blood Cells 1 Cell./1 million GB Quelques cellules /ml Endothelial Cells Tumor Cells Nécessité d’utiliser une technique d’enrichissement pour améliorer la sensibilité de détection des CEC

Comment définir les CEC ? ISTH: Proposition d’un consensus Blann AD, Woywodt A and Dignat-George F, Thromb Haemost, 228-35, 2005 CE matures détachées de la paroi vasculaire Reflètent les lésions ou morts endothéliales Cellules nucléées de diamètre 15-50µm Expression de marqueurs endothéliaux : CD146, vWF, CD31… Absence d’expression leucocytaire (CD45) et de marqueur d’immaturité (CD133) Pas de potentiel clonogénique Evènements rares vWF+

Techniques de détection des Cellules Endothéliales Circulantes 1. IMS (Séparation immuno-magnétique) Isolement + caractérisation au microscope 2. CMF (Cytométrie en flux) Analyse multi-paramétrique automatisée 3. Tests hybrides Isolement + Analyse multi-paramétrique automatisée

Numération des CEC par séparation immuno-magnétique + microscope (# 1) Critères d’identification : - Rosettes portant plus de 5 billes - Taille > 15 µm - Coexpression de marqueurs endothéliaux Valeurs normales < 10 CEC/ml

Détection des CEC par CMF : nécessité d’utiliser les bons marqueurs (# 2) CEC : CD45-, CD133-, CD146+, VEGFR1+, VEGFR2+

Détection des CEC par CMF : Marquage CD146 et CD45 CD146: Taux faibles sur les lymph. T activés vs taux élevés sur les CEC CEC Ly Ly

Désordres cliniques associés à des taux augmentés de CEC (#1) MALADIES CARDIOVASCULAIRES CEC/ml Angioplastie Coronaire Sbarbati et al, Blood, 1991 1 – 10 George et al, Thromb Haemost, 1992 6 - 10 Drépanocytose George et al, Blood,1992 13 – 43 Solovey et al, NEJM, 1997 4 - 40 Syndromes coronariens aiguës Mutin et al, Blood, 2000 4 – 47 Quilici et al, Circulation, 2004 Maladies vasculaires périphériques Makin et al, Eur Heart J, 2004 11 - 35 Hypertension artérielle pulonaire 50 Bull et al, Thromb Haemost, 2003 LESIONS INFECTIEUSES CEC/ml Rickettsioses 5 – 1600 Drancourt et al , J Infect Dis, 1992 George et al, Blood, 1993 Infections à Cytomegalovirus 0 - 50 Percivalle et al, J Clin Invest, 1993 Grefte et al, J Infect Dis, 1993 Septic shock 30 Mutunga et al, Am J Resp Crit Care Med, 2001 Valeurs normales : < 10 CEC/ml

CEC : marqueur de lésion endotheliale Le modèle de l’angioplastie coronaire Dignat-George et al, Thromb Haemos., 1992 Isolement des CEC par billes immuno-magnétiques CD146 Sample timing EC counted/ml blood May Grünwald Giemsa staining Electron microscopy of a Weibel-Palade body Elévation du taux de CEC après angioplastie coronaire Thrombomodulin staining

CEC dans les syndromes coronariens aigus Mutin et al, Blood, 1999, 93 : 2951-8 1000 D’où viennent-elles ? vwF+/CD36- 100 CECs / ml blood 10 Origine macrovasculaire 1 Sont-elles pathogéniques ? vwF+/TF+ Potentiellement pro-coagulantes C IdM AI Taux de CEC augmentés chez les patients Infarctus du myocarde (IdM) et angor instable (AI) Intérêts diagnostique et pronostique Quilici et al, Circulation, 2004

Désordres cliniques associés à des taux augmentés de CEC (#2) LESIONS IMMUNES CEC/ml Micro-angiopathie thrombotique Lefevre et al, Thromb Haemost,1993 6 - 220 Behçet’s disease Camoin et al, Thromb Haemost, 2000 0 – 27 Lupus érythémateux disséminé Clancy et al, Arthritis Rheum, 2001 25 - 39 Vascularites 136 Woywodt, Lancet , 2003 Maladie de Kawasaki Nakatani K, Clin Exp Immunol, 2003 15 TRANSPLANTATION CEC/ml Renal 24 – 72 Woywodt, Transplantation, 2003 Moelle osseuse 16 – 44 Woywodt, Blood, 2004 Normal values : below 10 CEC/mL (IMS)

Contribution des cellules endotheliales à l’angiogénèse tumorale (Rafii et al, Nature Cancer review, 2; 826. 2002)

Les CEC sont augmentées dans le sang périphérique des patients atteints de cancer Mancuso et al, Blood, 97; 11. 2001 CEC mesurées par CMF in 76 patients avec Lymphome malin non hodgkinien. Les taux de CEC étaient : Augmentées (x5 versus contrôle). - Corrélés aux taux sanguins de sVCAM-1 and VEGF Les taux de CEC revenaient aux taux des sujets sains contrôles chez 7 patients avec lymphome en rémission complète.

’’Multifaceted’’ endothelial cells in cancer Origines potentielles des cellules endothéliales dans le sang Niches de progéniteurs de CE Vaisseaux intra-tumoraux Vaisseaux normaux Détachement des CE matures ? - Stress mécanique - Cytokines et facteurs de croissance - Chimiothérapie et radiothérapie Mobilisation Hypoxie Facteurs de croissance Lésions

CEC et cancer Signification biologique - Altération de l’intégrité vasculaire - Angiogénèse active Elles contribuent au processus néoplasique et probablement à l’extension et progression tumorales. Marqueur prometteur en pratique clinique Marqueur de progression/activité de la maladie Index d’efficacité thérapeutique

Relation entre CEC et progression tumorale Le nombre de CEC varie avec - type de tumeur - localisation - stade ( métastatique ou non) Taux de CEC est élevé chez les patients avec maladie en progression - Tumeurs solides (Beerepoot, 2004) - K sein (Furstenberg,2006) Taux de CEC se normalise quand la tumeur est éliminée par la chirurgie (Mancuso 2001, Beerepoot 2004)

CEC et traitements antiangiogéniques du cancer Une des avancées thérapeutiques les plus récentes en oncologie. TTT anti-angiogénique : blocage de la néo-angiogénèse tumorale Arrêt de la progression tumorale +/- réduction tumorale Leur utilisation pourrait être améliorée par des marqueurs d’efficacité pharmacodynamique dont la mesure est peu invasive : - Pour « monitorer » l’activité biologique de la drogue utilisée - Pour définir la dose biologique optimale - Pour sélectionner les patients meilleurs répondeurs à ce TTT

CEC et traitement anti-angiogénique Progressive disease Clinical benefit CEC quantifiées par CMF (45/133-, 146/31+) chez 16 patients : - Tumeur stromale gastro-intestinale - Recevant Sunitinib (SUTENT®) Taux médians de CEC est multiplié par 3,5 fois au 1er cycle thérapeutique. Patients ayant une efficacité clinique : augmentation significative des CEC. (Norden-Zfoni et al , Clin Cancer Research 2007; 13:9, 2643)

CEC et réponse aux traitements anti-angiogéniques Altérations du taux de CEC sont associées à l’efficacité anti-angiogénique MAIS Résultats apparemment discordants : profils hétérogènes des variations du taux de CEC Interprétations multi-factorielles Mécanismes d’action des drogues anti-angiogéniques Temps de mesure des CEC par rapport à l’administration des TTT Phénotype utilisé pour la mesure des CEC (viable, apoptotique, activé)

Conclusion et futures directions CEC dans le cancer  Une nouvelle compréhension de la pathogénie tumorale  Un concept émergeant : - Pour l’évaluation de la croissance tumorale et son angiogénèse - Pour le monitoring de l’activité des drogues anti-angiogéniques Nécessité d’un consensus pour la définition phénotypique des CEC et les méthodes de mesure  une étape cruciale pour une définition claire de leur intérêt clinique dans le K.

Les microparticules circulantes Master 1 2015-2016 Dr GUILLET Benoît Unité d’Hémostase bioclinique (UHBIC), CHU Rennes Université Rennes 1

Quelle définition pour les microparticules ? - Vésicules résultant du blebbing des membranes cytoplasmiques cellulaires en réponse à une activation ou à l’apoptose. - Taille héterogène (diamètre: 0.1 to 1 µm ). - Eléments retrouvés après centrifugation vitesse rapide, mais pas ultracentrifugation : culot de cellules sans plasma. - Expression de phosphatidylsérine (PS) et antigènes des cellules dont elles dérivent, mais à taux d’expression variable (quel seuil de détection ?) - Support des réactions de coagulation, d’intensité variable (détection des PS and TF à taux variable : quel seuil ?) PC PS PS + MP PC PS = phosphatidylserine PC= phosphatidylcholine PS PC flip-flop vesiculation Annexin V- FITC

Origine des microparticules Marqueurs spécifiques Plaquettes activées CD41, … Cellules endothéliales activées CD31, CD146,… Monocytes activés CD45, CD14,… Erythrocytes activés … Glycophorine A Méthodes de détection spécifique : cytométrie en flux

Génération de MPs d’origine endothéliale Cellules endothéliales en culture (HUVEC) Au repos Après activation par TNFa Combes et al. JCI 1999

Anatomie d’une microparticule cellulaire Hugel et al Physiology 2005

Mécanismes de formation des MPs

Cellule au repos Asymétrie membranaire phospholipidique SM + PC Translocase active : maintien des PS et PE vers l’intérieur PS + PE Floppase active : Transport de l’ext. vers l’intérieur non spécifique. Scramblase inactive SM : sphingomyéline PC : phosphatidyl-choline PS : phosphatidyl-sérine PE : phosphatidyl-éthanolamine Piccin et al Blood Reviews 2007

Activation cellulaire Activation de la Scramblase par le Ca2+ Inactivation de la Translocase par le Ca2+ Clivage des protéines liées à l’Actine Clivage des longs filaments d’Actine Relargage du Ca2+ du RE Activation des enzymes Calpaïne et Gelsoline Piccin et al Blood Reviews 2007

Désorganisation du cytosquelette sous-membranaire après activation Début de vésiculation de la membrane Perte de l’asymétrie membranaire Clivage de la Spectrine et Actine Perte du point d’ancrage protéique de la membrane au cytosquelette Piccin et al Blood Reviews 2007

= MP exprimant la PS vers l’ext. Génération de MPs Microvésiculation = MP exprimant la PS vers l’ext. Piccin et al Blood Reviews 2007

Propriétés biologiques des MPs Angiogénèse Croissance tumorale Thrombogénèse Réponse immunitaire Activités procoagulantes Propriétés pro-inflammatoires Délivrance de cytokines Propriétés protéolytiques Délivrance de F. de croissance Interactions cellulaires Transfert d’antigènes Activation cellulaire - Inflammation - Thrombogénèse - vasomotricité Prolifération Différenciation

Propriétés pro-coagulantes des MPs Mécanisme physiologique de la coagulation Apport de nombreux sites de liaison phospholipidiques (PS et PE) aux facteurs de la coagulation (FIXa, FVIIIa, FVa et FIIa) Coagulation Les MPs d’origine endothéliale expriment des MHPM de facteur Willebrand Hémostase primaire +++ Expression de P-sélectine sur les MPs plaquettaires Expression de Facteur tissulaire et PSGL-1 (ligand de la P-sélectine) sur les MPs monocytaires Ex: rôle des MPs monocytaires dans l’hémostase Plaquette activée CD62P MP monocytaire PSGL-1 FT FVII FVIIa FXa FIIa FIBRINE

Propriétés pro-coagulantes des MPs Implication des MPs dans différentes pathologies Dysrégulations pathologiques variations de la nature et/ou de la proportion des MPs (variations qualitatives et/ou quantitatives) Une augmentation de la quantité de MPs Augmentation du potentiel thrombotique Taux augmentés de MPs : Maladies cardio-vasculaires (IdM) Syndrome des anticorps anti-phospholipides Vascularites Micro-angiopathies thrombotiques Thrombopénies induites par l’héparine Hémoglobinurie paroxystique nocturne Sepsis

MPs et immunité MPs : vecteurs d’échappement immun Physiologique : Grossesse = Cellules trophoblastiques sécrètent des MPs contenant du FasL (1er trim.) Mort par apoptose des Cellules T présentant Fas Régulation négative de la réponse immune maternelle Cancer Cellules tumorales en culture : sécrétion de MPs portant le FasL Cellules K ovariennes épithéliales : sécrétion de FasL via leurs MPs (alors que les cellules épith. Ovaire normales ne sécrètent pas de FasL) Apoptose des lymphocytes présentant Fas Absence de réponse immune anti-tumorale

MPs et Cancer Echappement immun (cf ci-dessus) MPs et état pro-thrombotique des Cancers Cancer du poumon : augmentation des MPs monocytaires Un des facteurs de l’augmentation du potentiel pro-thrombotique MPs et métastases Rôle des MPs dans les métastases de K gastriques ? Corrélation taux élevé de MPs plaquettaires et métastases MPs et résistance à la chimiothérapie Accumulation de doxorubicine dans les MPs issus de cellules cancéreuses Hypothèse : mécanisme d’élimination des drogues toxiques intra-cellulaire

MPs et Angiogénèse Les MPs plaquettaires sont des inducteurs de l’angiogénèse in vitro et in vivo. Fusion des MPs avec la membrane des hémangioblastes et/ou progéniteurs endothéliaux = expression de surface des GP plaq. Homing endothélial Chimiotactisme +++ Adhésion cellulaire Prolifération et survie cellulaire Exp chez des rats (IdM) : injection locale de MPs plaq. => Revascularisation du myocarde ischémique Certaines MPs tumorales expriment fortement la sphingomyéline : = composant lipidique pro-angiogénique

MPs et Diabète Nombreuses cellules relarguent des MPs : Plaquettes, cellules endothéliales, monocytes, cellules des ilôts de Langherans. Stimulées par cytokines (TNFa, IL-1b, CD40L soluble), l’hyperglycémie, le stress oxydatif. Le phénotype des MPs et leur potentiel pro-coagulant varient en fonction du type de diabète et du contrôle de la glycémie Potentiel pro-coagulant +++ quand taux HbA1C augmenté MPs endoth. et plaq. +++ dans diabète de type 1 : Taux + élevés chez patients avec complications microvasculaires. Dans le diabète type 2 : des taux élevés de MPs monocytaires et plaq. = indicatifs de néphropathie et rétinopathie. Au cours des IdM : augmentation importante des MPs endoth., plaq. et monocytaires quelque soit le type de diabète.

Méthodes de dosage des microparticules Il n’y a pas de méthode véritablement consensuelle pour la détermination des MPs : approches héterogènes (protocoles, marqueurs, valeurs normales,…) Nécessité de standardisation

Détection des Microparticules: Différentes méthodes sont utilisables Cytométrie en flux Specific antigen/ antibody and PS/ AnnV Numeration / Cellular Origin Tests pro-coagulants fonctionnels PS /Prothrombinase activity TF/ Thrombin generation Procoagulant potential Tests de capture (ELISA) PS,Ag Capture/procoagulant activity (Prothrombinase activity) / Cellular Origin

Analyse des MPs par cytométrie en flux Contrôle et calibration Paramètres SS and FS 0.5µm 0.9µm 3µm 10µm Contrôle et calibration de la taille Utilisation de billes de taille différentes Première sélection des MPs par la taille

Analyse des MPs par cytométrie en flux Calibration par des billes pour la numération des MPs CD41 PE AnnexinV FITC Marquage MPs Origine des MPs : plaquettes Analyse de Fluorescence de la région contenant les MPs AnnexinV FITC CD41 PE

Tests pro-coagulants fonctionnels et test de capture immunologique Tests fonctionnels Ca2+ X Activité facteur tissulaire TF VIIa TF mAbs Ca2+ Xa Va Xa II IIa Ca2+ Génération de thrombine PS PS Annexin V binding Test combiné Capture PS + activité procoagulante