Investigations techniques Licence de biologie humaine-Technologie de la santé Semestre 6 2011-2012 Investigations techniques en physiopathologie cellulaire et moléculaire Partie I « Electrophysiologie: introduction aux techniques de patch clamp et d’imagerie calcique » Intervenant: M. HAMMADI UFR des sciences Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire JE 2530 « Canaux ioniques dans le cancer du sein » Bât Minimes m.hammadi.upjv@gmail.com

Canaux ioniques ADP ATP Diversité des canaux ioniques K+ Ca 2+ Na+ Pompe Membrane plasmique ADP ATP IP3 R RyR cytoplasme Réticulum endoplasmique Ca 2+ Ca 2+ Pompe Canaux de fuite ADP ATP

Canaux ioniques Implications physiopathologiques des canaux ioniques Implications physiologiques Canaux K+ et Ca 2+ : Prolifération , cycle cellulaire Différenciation Apoptose Migration Invasion Implications pathologiques Canalopathies Les canalopathies identifient un ensemble de maladies génétiques résultant d’un dysfonctionnement des canaux ioniques suites à des mutations observées dans les gènes codant ces protéïnes.

Canaux cationiques Acétylcholine : Myopathies Myasthénies

Canaux cationiques PKD2 (TRPP1) : Polykystose rénale infantile

Canaux cationiques GMPc / AMPc: Daltonisme

Canaux Na+ : Epilepsie Syndrome de Brugada (Nav1.5)

Canaux K+ : Syndrome du QT long (Repolarisation défectueuse) Surdité

Canaux Ca2+ : Ataxie Migraine

Canaux Cl- : Mucoviscidose Epilepsie Surdité

Jonctions communicantes : Pertubation de l’audition

Implication des canaux ioniques dans de nombreux cancers

Etude de l’homéostasie Canaux ioniques Méthodologie Expression Rôle dans la prolifération, l’invasion ou la migration? RT-PCR Bleu trypan Test de migration Etude de la fonctionnalité Etude de l’homéostasie calcique

Partie 1 : Technique de patch clamp

Distribution des ions déséquilibrée Généralités Na+ (145 mM) Na+ (10 mM) K+ (150 mM) K+ (5) Cl- (147 mM) Cl- (10 mM) Ca2+ (0,0001 mM) Ca2+ (1,8 mM) Membrane cytoplasmique Interieur exterieur Pompe ionique Rappels Au repos: Distribution des ions déséquilibrée Il existe des pompes qui permettent le maintien des gradients de concentrations La bicouche lipidique étant imperméable aux ions, les mouvements passifs se font au niveau de protéines transmembranaires spécialisées: les canaux ioniques dont la structure tridimensionnelle délimite un pore aqueux au travers duquel passent sélectivement certains ions.

Généralités Rappels Le K+ diffuse en suivant son gradient de concentration Le K+ est attiré par les charges - de l'intérieur et repoussé par les charges + de l'extérieur Le flux ionique né d'un gradient de concentration est autolimité par le champ électrique qu'il engendre (équation de Nernst). La diffusion s’arrête lorsque le gradient électrique = gradient de concentration.

RT [ion]ext ln Eion= ZF [ion]int Généralités Rappels Enoncé de la loi de Nernst (1889) Eion= RT ZF ln [ion]ext [ion]int = potentiel d’équilibre d’un ion R : constante des gaz parfaits 8,315 J.K-1.mole-1 T : température en degrés kelvin (°K= °C +273,16) Z : valence de l’ion F : constante de Faraday (9,648.104 C. mole-1) Ln= 2,303 log Si z=+1 et T=20° On a alors : Eion= 58 log [ion]ext [ion]int

RT [ion]ext ln Eion= ZF [ion]int Généralités Rappels Enoncé de la loi de Nernst E potassium = -80 mV E sodium = +60 mV E calcium = +120 mV E chlore = -60 mV Eion= RT ZF ln [ion]ext [ion]int = potentiel d’équilibre d’un ion Pour traverser la membrane, un ion est soumis à un gradient électrochimique ("driving-force" ), qui s'exprime par la différence entre le potentiel de membrane (Vm) de la cellule et le potentiel d'équilibre de l'ion considéré (Eion). On a : GE=Vm-Eion Si Vm= -60mV

Technique de patch clamp Généralités Chaque déplacement de charges a pour conséquence la formation d’un courant. Objectif de l’électrophysiologie: Mesure des courants ioniques. L'intensité du courant (I ion, exprimé en Ampères : Coulombs.sec-1) traversant un canal ionique (courant ionique élémentaire) est égale à : Courant ionique membranaire (Iion) = gion (Vm - Eion) Conductance (nombre de canaux) Flux net (gradient electrochimique) Technique de patch clamp

Patch clamp Matériel utilisé en patch clamp cellule Inventé par E. Neher et B. Sakmann (1981). Technique de référence pour l’étude électrophysiologique des canaux ioniques. Solution intracellulaire Micropipette de verre (1µM O) cellule Le patch-clamp consiste à enregistrer l’activité électrique d’un fragment microscopique de membrane cellulaire, isolé électriquement du reste de la surface cellulaire et ne contenant que quelques canaux.

Patch clamp Matériel utilisé en patch clamp La micropipette de patch : Étireuse : Permet à partir d’un capillaire de verre de faire deux micropipettes de patch Microforge : Permet d’affiner la micropipette de patch

Patch clamp Matériel utilisé en patch clamp Amplificateur Système de perfusion Télégraphe Cage de Faraday Interface d’acquisition Pipette de perfusion Microscope Micromanipulateur Pipette de patch (microélectrode d’argent chlorée) Système de micromanipulation Table antivibratoire

Patch clamp Techniques d’enregistrement de l’activité des canaux ioniques Patch perforé Cellule attachée Cellule entière Outside-out Inside-out

Patch clamp Intérêts des différentes techniques d’enregistrement Inside-out outside-out Cellule entière Courant unitaire Courant global

Patch clamp Méthodes d’enregistrement Amener la pipette de verre à proximité de la cellule via le micromanipulateur Resistance faible (3-7MΩ) = résistance de la pipette La pipette touche la cellule (jonction cellule-pipette) Resistance supérieure Aspiration de la portion membranaire située sous la pipette (configuration cellule entière) Augmentation de la résistance jusqu’à l’atteinte d’1 giga ohm = giga seal (109 Ω) = stabilité mécanique La jonction doit être étanche , sans courant de fuite Imposition d’un potentiel (mV) Enregistrement du courant (nA,pA)

I= U/R Patch clamp Méthodes d’enregistrement Technique basée sur la loi d’ohm: U= R.I Avec I= ampères U= volts R= ohms I= U/R Enregistrement d’un courant Potentiel imposé Protocoles d’enregistrement (potentiel imposé) Steps (créneaux de potentiels) Rampes +100 -100 +100 -100

Courant membranaire Global Courants unitaires Exemple de tracés Exemple de droite i=f(Vm) ix = ץ x (Vm-Ex) Exemple cas de ik,V Courant membranaire Global Exemple de tracés Exemple de courbe i=f(Vm) Ix = G x (Vm-Ex) G= N x P0 x ץ Exemple cas de iNa,V

Patch clamp Exemple Etude de la fonctionnalité du canal potassique voltage dépendant hEag1 Changement de pente = seuil d’activation. 2) Modification du signe du courant = potentiel d’inversion (Er). 3) Partie linéaire = état d’activation maximal de la conductance g. Le courant est alors directement proportionnel à Em-Er. I=g.(Em-Er). La pente de la courbe I-V donne la conductance g. 3 1 2 Exemple de tracés du courant unitaire hEag1 : Le courant potassium est obtenu par la technique de patch-clamp (mode voltage-imposé ; configuration inside-out), en imposant une série de dépolarisations membranaires allant de -80mV à +80mV par saut de 20mV. L’intensité maximale obtenue pour chaque créneau de dépolarisation est reportée sur la courbe I/V. Le seuil d’activation de ce courant est déterminé entre -40 et -30mV. D’après (Ludwig et al., 1994)

Partie 2 : Technique d’imagerie calcique

Importance de la localisation et de la durée du signal calcique. Imagerie calcique Généralités Implication du calcium dans les processus physiopathologiques Importance de la localisation et de la durée du signal calcique.

Imagerie calcique Généralités Objectifs Mesure des variations de concentrations en calcium intracellulaire Etude des canaux calciques « LE CALCIOSOME » ( le répertoire des acteurs impliqués dans l’homéostasie calcique) Canaux Ca2+ cytosol Na+/Ca2+ Ca2+ PMCA RE IP3R RYR Mitochondrie SERCA ATP ADP Canal de fuite influx du Ca2+ (canaux ioniques, pompes et échangeurs) les stocks intracellulaires de Ca2+ et leurs régulateurs les tampons calciques les enzymes dont l’activité dépend du Ca2+  facteurs de transcription dépendant du calcium CaM CRT Noyau NF-AT

Imagerie calcique Généralités Objectifs Mesure des variations de concentrations en calcium intracellulaire Etude des autres canaux ioniques Exemple: étude de l’impact d’un canal K+ Canaux calciques Activation des canaux calciques Ca2+ SERCA RE Cytoplasme

+ Imagerie calcique Généralités Objectifs Mesure des variations de concentrations en calcium intracellulaire Etude des autres canaux ioniques Exemple: étude de l’impact d’un canal K+ Canaux calciques Canal K+ Activation des canaux calciques Ca2+ Activation des canaux potassiques calcium dépendants + K+ SERCA RE Cytoplasme

+ + Imagerie calcique Généralités Objectifs Mesure des variations de concentrations en calcium intracellulaire Etude des autres canaux ioniques Exemple: étude de l’impact d’un canal K+ Canaux calciques Canal K+ Canaux calciques Activation des canaux calciques Ca2+ Activation des canaux potassiques calcium dépendants + Ca2+ + Hyperpolarisation de la membrane Augmentation de la driving force (Em-ECa2+) pour le calcium transitant à travers les canaux calciques K+ RE Cytoplasme

+ + Imagerie calcique Généralités Objectifs Mesure des variations de concentrations en calcium intracellulaire Etude des autres canaux ioniques Exemple: étude de l’impact d’un canal K+ Canaux calciques Canal K+ Canaux calciques Activation des canaux calciques Ca2+ Activation des canaux potassiques calcium dépendants + Ca2+ + Hyperpolarisation de la membrane Augmentation de la driving force (Em-ECa2+) pour le calcium transitant à travers les canaux calciques K+ Augmentation du calcium dans le cytoplasme, dans le RE/RS et dans le noyau SERCA Modification de l’expression des gènes et la synthèse protéique RE Cytoplasme Variations de processus physiologiques (prolifération, différenciation, apoptose…)

Imagerie calcique Généralités Protocole Sonde fluorescente = charge des cellules Montage sous microscope Mesure Analyse des informations

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Objectif Mise en contact des cellules avec la sonde fluorescente Sonde fluorescente 45 mn, obscurité

Imagerie calcique Charge des cellules Les sondes fluorescentes Sondes fluorescentes calcium-dépendantes Quin 2 Fluo 3 Indo 1 Fura 2 Dérivé de chélateur calcique (BAPTA, EGTA) couplé à un fluorophore

Imagerie calcique Charge des cellules Les sondes fluorescentes Fura-2 4 groupements COO- associés à un fluorophore KD= 145 nM anions polycarboxylés imperméants Interaction ca2+

Imagerie calcique Charge des cellules Les sondes fluorescentes Fura-2 4 groupements COO- associés à un fluorophore KD= 145 nM anions polycarboxylés imperméants : utilisation d’une forme acétométhylester = FURA-2-AM (hydrophobe, perméante) Fura 2 Fura-2-AM Fura-2-AM Interaction ca 2+ estérases

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Les sondes fluorescentes Fura-2 FURA-2-AM Propriétés: 2 longueurs d’ondes d’excitation (350nm et 380nm) 1 longueur d’onde d’émission (515nm) Sonde liée au Ca 2+ Sonde libre Déplacement du spectre d’émission du Fura-2 à 515 nm en fonction de la concentration en Ca2+

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Microscope Les cellules sont cultivées sur lamelles de verre. La lamelle est récupérée et placée sur une boite de montage perçée en son centre. cellules Microscope

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Poste d’imagerie

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Lors de l’expérience… La lampe xénon est une source de lumière blanche qui est filtré de manière à ce que la sonde calcique soit excitée par une seule longueur d’onde. Le signal fluorescent renvoyé par la sonde est modifié par un système de miroirs puis amplifié avant d’être capté par la caméra. Les images sont enfin transférées à l’ordinateur pour l’enregistrement et l’analyse des données.

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Lors de l’expérience…

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Lors de l’expérience… Excitation 350nm (forme liée) Lampe Emission à 515nm Ordinateur Excitation 380nm (forme libre)

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Enregistrement Excitation 350nm (forme liée) Lampe Emission à 515nm Ordinateur Excitation 380nm (forme libre) 350nm 350/380 Tps (s) Tps (s) 380nm Tps (s)

Imagerie calcique Généralités Charge des cellules Montage Acquisition Enregistrement Exemple 10mM Ca 2+ 10mM Ca 2+ TG TG [Ca2+] cyt

CALIBRATION DES SIGNAUX Imagerie calcique CALIBRATION DES SIGNAUX Nécessité d’utiliser une sonde ratiométriques, à 2 pics d’excitation ou à 2 pics d’émission. Exemple du Fura 2 : ( exc : 350 nm (lié au Ca2+) ; 380 nm (forme libre ;  ém : 510 nm). I340 = intensité de fluorescence à 340 nm ; I380 = intensité de fluorescence à 380 nm ; R = I340 / I380 La [Ca2+] libre est décrite selon l’équation de Grynkiewicz (1985) : [Ca2+] = Kd . . (R - Rmin) / (Rmax - R) Rmin obtenu en absence de calcium : I340 bas Ca2+/ I380 bas Ca2+ Rmax obtenu quand la sonde est saturée en Ca2+ : I340 haut Ca2+/ I380 haut Ca2+ Kd : constante de dissociation de la sonde (fournie par le fabricant)  : I380 bas Ca2+/ I380 bas Ca2+

Imagerie calcique AVANTAGES Spécificité Kd élevé: fluorescences mesurables pour des concentrations en calcium faibles (50nM à quelques µM) Haute sensibilité de détection  Haute résolution dans le temps et dans l’espace PROBLEMES RENCONTRES Bruit de fond  Autofluorescence  Sonde liée de façon non spécifique. « Photobleaching »  Exposition forte à la lumière fluorescente = décroissance fluorescence émise Possibilité d’une hydrolyse incomplète des esters. Compartimentation de la sonde (RE, Golgi). Phototoxicité = formation d’espèces toxiques : radicaux libres par réaction de la molécules excitée avec l’O2.