Clonage d’un gène et transfert dans une cellule eucaryote

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1 Clonage d’un gène et transfert dans une cellule eucaryote
Pages 11 à 15 Transfert indirect via une bactérie Agrobacterium tumefaciens Transfert direct

2 Transfert indirect de gènes
Page 11 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Pathogène des végétaux → tumeurs au site d’infection (galle du collet) ? = Excroissance tumorale = zone de liaison entre tige et racine

3 Transfert indirect de gènes
Page 11

4 Transfert indirect de gènes
Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Structure Bâtonnet (bacille) + flagelles

5 Transfert indirect de gènes
Page 11 Ti = inducteur de tumeur

6 Transfert indirect de gènes
Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Utilisation d’ une bactérie = Agrobactérium tumefaciens Localisation Sol

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Page 11 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 1.- Blessure au niveau de la plante (microblessures: insectes, vers, formation de racines latérales, gel… 2.- Emission de composés phénoliques 3.- Chimiotactisme d’Agrobactérium tumefaciens

8 Transfert indirect de gènes
Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 4.- Composés phénoliques activent la région de virulence Code une endonucléase → ADN-T

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Page 11 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 5.- La bactérie est capable de se fixer aux Ȼ de la blessure 6.- La bactérie transfert une partie de son matériel génétique

10 Transfert indirect de gènes
Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens

11 Transfert indirect de gènes
Page 11 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 7.- L’ADN-T s’intègre à celui de la plante 8.- La plante produit ↑ d’hormones de croissance

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Page 11 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 9.- Croissance désordonnée et illimitée des Ȼ infectées → tumeur

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Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens 10.- La plante synthétise et libère dans le sol des opines 11.- Opines → nutriments pour Agrobactérium tumefaciens

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Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens Opines: - Petite molécule formée d’un acide aminé + acide cétonique ou un sucre - Source de C et N pour la bactérie

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Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Infection naturelle par Agrobactérium tumefaciens

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Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt Remplacement de l’ADN-T par un gène d’intérêt

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Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Modification du plasmide d’Agrobactérium tumefaciens avec un gène d’intérêt Gène de sélection ? Gène permettant la survie des Ȼ dans des conditions particulières (résistance à un antibiotique) ou gène → molécule fluorescente ou radioactive…. Repérer facilement les Ȼ qui ont intégré l’ADN transgénique

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Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Provoquer des blessures chez la plante Fragments de feuille Fragments de tige Embryon Bactéries modifiées misent en contact avec les fragments de plante

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Page 12 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes

20 Transfert indirect de gènes
Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Les fragments de plante sont cultivées sur un milieu sélectif (antibiotique) → Mettre en évidence la présence ou l’absence du gène de sélection Développement de cals (= amas de Ȼ végétales) transgéniques → plantules transgéniques portant et exprimant le gène d’intérêt.

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Page 13

22 Transfert indirect de gènes
Page 13

23 Transfert indirect de gènes
Page 13 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Première plante modifiée par Agrobactérium tumefaciens = plante de tabac → résistante à certaines chenilles qui les dévorent jusqu’à la tige

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Page 13 Transfert de plasmide dans des Ȼ eucaryotes Autres plantes: Tomate Pomme de terre Soja Coton … Pas de céréales

25 Transfert indirect de gènes
Page 13 Agrobactérium tumefaciens n’induit pas de tumeur chez les céréales car elles ne produisent pas de composés phénoliques en cas de blessures en quantité suffisante pour permettre l’expression du gène « vir ».

26 Transfert indirect de gènes
Depuis quelques années, des expériences ont été faites pour permettre la transformation du riz ou du maïs Comment ? Culture d’embryons de riz et d’Agrobactérium t. en présence de composés phénoliques → ↑ transfert (100%) Souches d’Agrobactérium t. « supervirulente »

27 Clonage d’un gène et transfert dans une cellule eucaryote
Page 14 Transfert indirect via une bactérie Agrobacterium tumefaciens Transfert direct Différentes techniques (4)

28 Transfert direct de gènes
Pages La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ végétales sans paroi cellulosique (enzymes)) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes ») Protoplastes Ȼ végétales

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Page 14 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique (enzymes)) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

30 Transfert direct de gènes
Page 14 Le polyéthylèneglycol (PEG) = agent chimique → déstabiliser la membrane plasmique des protoplastes → faciliter la pénétration de l’ADN

31 Transfert direct de gènes
Page 14 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques (4) Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

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Page 14 L’électroporation (technique plus délicate) = chocs électriques de fort voltage → ouverture de pores au niveau des protoplastes → faciliter le passage de l’ADN

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Page 14

34 Transfert direct de gènes
Page 14 Problème avec ces deux techniques Faible capacité de régénération des protoplastes Transfert de plusieurs copies → répercussions sur la stabilité de l’insert (gène) ou sur son expression

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Page 15 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

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Page 15 La microinjection (technique complexe) = introduction directe de molécules, organites dans des cellules isolées à l’aide de microseringues manipulées sous microscope

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38 Transfert direct de gènes
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39 Transfert direct de gènes
Page 15 La première méthode fut l’introduction d’ADN dans des protoplastes (Ȼ sans paroi cellulosique) Techniques chimiques ou physiques Le polyéthylèneglycol (PEG) L’électroporation La microinjection Méthode biolistique (« canon à gènes »)

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Page 15 La méthode biolistique ou canon à gènes = propulsion d’un transgène à l’intérieur de cellules végétales, isolées ou appartenant à un tissu ou à un organe - Constructions moléculaires sont fixées à la surface de projectiles microscopiques (billes d’or) - Bombarder les cellules végétales

41 Transfert direct de gènes
Page 15 La méthode biolistique ou canon à gènes