Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Saclay 29 Juin 2009 Les microbes anges gardiens de la biosphère.

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2 Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Saclay 29 Juin 2009 Les microbes anges gardiens de la biosphère

3 Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684Antonie van Leeuwenhoek

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5 Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684Antonie van Leeuwenhoek 1838Schwann (levure ferment vivant) 1857Pasteur (fermentation lactique) 1860Pasteur (fermentation alcoolique) 1864Pasteur (génération spontanée) 1881Koch (cultures pures)

6 Postulats de Koch Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes

7 Au cours des années 70 Carl Woese procède à des comparaisons systématiques de séquences d ’ARN des ribosomes de bactéries

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11 TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA abcdefgabcdefg fg e acb d

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16 Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces ADN Extraction Echantillon de l'environnement PCR gènes d‘ARNr 16S amplifiés Clonage dans E. coli Clones séquençage sequences d‘ARNr 16S Analyse de séquences

17 Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces ADN Extraction séquençage PCR gènes d‘ARNr 16S amplifiés Clonage dans E. coli Clones sequences d‘ARNr 16S Analyse de séquences Extraction Echantillon de l'environnement

18 Par cette approche Norman Pace observe dans les années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent pas à des espèces connues cultivées.

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20 MinimumOptimumMaximum TempératureélevéethermophilePyrolobus fumarii90°C106°C113°C bassepsychrophilePolaromonas vacuolata0°C4°C12°C pHacideacidophilePicrophilus oshimae0,060,7 (60°C)4 alcalinalcalinophileNatrialba magadii8,5912 pressionélevéebarophile MT41 (Mariana Trench) 11033 mètres de profondeur 500 atm 700 atm 4°C > 1000 atm salinitéélevéehalophile Halobacterium salinarum 15 %25 % 32 % (saturation) Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières …

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22 Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources énergie matières premières (minérales ou organiques) Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à l'innovation 1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières 2) en s'adaptant à des environnements particuliers

23 énergie oxydoréductions chimiques différents oxydants, différents réducteurs lumière plusieurs utilisations de la lumière avec ou sans production d'O2 matières premières (minérales ou organiques) C minéral (CO2 ou organique) N atmosphérique ou sels conditions du milieu température pH ions

24 Streptococcus pneumoniae Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Salmonella Pseudomonas Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage Chondromyces

25 HabitatNombre de bactéries% de bactéries cultivables Sol10 10 - 10 13 / kg0,01 - 0,1 Rivières, lacs10 9 - 10 10 / l0,01 - 0,1 Océans (surface)10 7 - 10 9 / l0,001 - 0,1 Océans (profondeur)10 7 - 10 8 / lindéterminé Océans (sédiments)10 9 - 10 12 / l< 1 % Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours

26 Sols 10 7 à 10 10 bactéries / g Eauxpotable en généralmaximum 1000 bactéries / mL bassin de natation100 bactéries / mL mer peu polluée10.000 bactéries / mL Alimentslait stérilisémaximum 100 bactéries / mL viande hachée10 6 bactéries / g Corps humain sain et propre peau du dos100 à 1000 bactéries / cm2 peau des aisselles ou du pubis 10 6 bactéries / cm2 fèces50 % de la masse soit 10 11 bactéries / g Les bactéries sont partout et nombreuses...

27 La flore intestinale humaine Cent mille milliards de bactéries !!! Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive. Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie. Les interactions entre l’organisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé.

28 Au niveau de la planète la biomasse microbienne représente plus de la moitié de la biomasse terrestre

29 0,01 0,1 1 10 100 100 10 1 0,1 Si Mg O Ca Na P N C S H Croûte terrestre Biomasse

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32 0,01 0,1 1 10 100 100 10 1 0,1 Si Mg O Ca Na P N C S H Croûte terrestre Biomasse

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35 Le rôle de l'infiniment petit dans la nature est infiniment grand Louis Pasteur

36 Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines d’espèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées Moins de 1% des bactéries sont cultivées Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement A ce jour

37 Objectifs des Projets Génome Etablir un inventaire des gènes de l’espèce considérée Identifier les autres éléments structuraux et leur fonction biologique, sur la séquence de référence Analyser le fonctionnement du génome considéré (expression et régulation etc.) Rechercher les mutations à l'origine de phénotypes particuliers assise pour de nouvelles approches expérimentales Evolution/Phylogénie Applications médicales (diagnostic et thérapeutique) Applications agronomiques/biotechnologiques

38 Quels génomes séquence-t-on ? organismes modèles (génomes modèles) organismes d'intérêt médical organismes d'intérêt économique, biotechnologique organismes d'intérêt environnemental organismes occupant des positions clés dans l'arbre du vivant

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41 Le paysage des séquences de génomes en mars 2009

42 Projets Procaryotes Le paysage des séquences de génomes en mars 2009

43 Séquençage 2 ème génération : équipements Roche / 454 GS Titanium Illumina / Solexa Genome Analyzer Applied Biosystems SOLiD Titanium 400 b/lecture 600 Mb / run GAII 50-100 b/lecture. 60 M tags ~10 Gb / run GAIIx (mi - 2009): 125-150 b/lecture (ou 250 par paires) V3 : 50 b/lecture 250 M tags / run (~10-20 Gb)

44 3 ème génération vers 2011-2012 – PacificBio SMRT –ABI Visigen – Illumina Oxford Nanopore

45 Y a-t-il encore un besoin de séquence ? inépuisable intérêt des comparaisons (toute nouvelle comparaison apporte un nouvel éclairage) de nombreux phylums totalement inexplorés re-séquençage pas de limite scientifique au besoin, mais limites économiques

46 De nombreuses raisons de s'intéresser aux communautés bactériennes - impact sur les équilibres biogéochimiques - quels sont les acteurs ? - nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments - impact sur la santé (flores microbiennes humaines) - modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes) - utilisation de la biodiversité à des fins d'applications - substances thérapeutiques - substances d'intérêt industriel - enzymes utiles pour la chimie de synthèse - bioremédiation - nouveaux éclairages sur l'évolution

47 Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ? - rDNA 16S - FISH - métagénomique - techniques sur cellules isolées - culture

48 ADN Extraction séquençage Clonage dans E. coli Clones sequences d‘ADN Analyse de séquences Extraction Echantillon de l'environnement La métagénomique

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51 Problèmes d'analyses des données d'un métagenome Données très fragmentaires Liens perdus avec les cellules d'origine La grande majorité de ces cellules sont inconnues

52 Résultats : Hybridation in situ sur les boues 10 µm Floc du bassin aérobie (BA) photo CLSM (gross. 630) hybridation avec sonde : - groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5 - sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3 - superposition Pla46F et 322R - autofluorescence

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54 Quelques résultats de la métagénomique - reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs bactéries non cultivables - présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine dans les bactéries - découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction inconnue - association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité

55 Dans une économie qui essaie petit à petit de s'orienter vers le "durable" la chimie de synthèse souffre d'une série majeure de défauts - elle pollue considérablement procédés déchets CO 2 - elle est entièrement dépendante du carbone fossile matière première source d'énergie La chimie de synthèse, activité industrielle mal aimée entre toutes

56 - concevoir des procédés ayant des rendements tendant à maximiser la quantité de matières premières retrouvées dans le produit final - utiliser des substances sans danger pour la santé et l'environnement (notamment les solvants) chaque fois que possible - concevoir des procédés avec une bonne efficacité énergétique - traiter les déchets ou mieux ne pas en produire Les lignes directrices de la Chimie Verte La chimie faite par le vivant est une chimie verte par construction

57 - pas de déchets ou des déchets recyclables - utilise des substances sans danger pour la santé ou l'environnement - matières premières renouvelables (C de la biomasse) - biocatalyseurs hautement spécifiques - minimisant ou évitant la synthèse de sous-produits à éliminer - augmentant les rendements - biocatalyseurs fonctionnent en milieu aqueux dans des conditions douces de température, pression et pH Les potentialités de la biotechnologie industrielle ou biotechnologie blanche ?

58 limitations Le nombre d’activités biocatalytiques connues utiles à la chimie de synthèse est une des limitations principales de la biotechnologie industrielle Le nombre d'enzymes inconnus, dans les génomes bactériens séquencés et dans les métagénomes, dépasse largement le nombre d'enzymes connus

59 Pan-génome bactérien ensemble des gènes bactériens

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