Le gène wdr73 est responsable du syndrome de galloway-mowat

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1 Le gène wdr73 est responsable du syndrome de galloway-mowat
Estelle Colin, Evelyne Huynh Cong, Géraldine Mollet, Agnès Guichet, Olivier Gribouval, Christelle Arrondel, Olivia Boyer, Laurent Daniel, Marie-Claire Gubler, Zelal Ekinci, Michel Tsimaratos, Brigitte Chabrol, Nathalie Boddaert, Alain Verloes, Arnaud Chevrollier, Naig Gueguen, Valérie Desquiret-Dumas, Marc Ferré, Vincent Procaccio, Laurence Richard, Benoit Funalot, Anne Moncla, Dominique Bonneau, et Corinne Antignac UMR INSERM 1083 – CNRS 6214 Travail Collaboratif avec l’unité Néphropathies héréditaires et rein en développement de Necker (Inserm/Université U 983 – Pr C. ANTIGNAC) 8èmes assises de génétique Lyon 04 février 2016

2 Introduction Galloway-Mowat syndrome (GMS)
Pathologie rare autosomique récessive Atteinte rénale Protéinurie isolée Syndrome néphrotique cortico-résistant Atteinte du système nerveux central Microcéphalie Anomalies cérébrales Retard psychomoteur Age de décès ≈ 6ans 2014: 64 cas rapportés sans cause moléculaire 2016: 110 cas dont 47 mutés dans WDR73 (poster # 3507) Primary microcephaly = at birth / secondary microcephaly = postnatally Major brain abnormalities= cerebral atrophy, neural migration defects

3 Processus Individus SNP arrays Exome sequencing 2 frères atteints
famille d’origine marocaine SNP arrays 1 seule zone de ROH 4.3 Mb sur le chromosome 15 24 gènes Both children have a secondary microcephaly, severe neurological impairment, and one developped a NS. Exome sequencing: Average read coverage 64 X, 77% of targeted bases were covered by 25 reads Exome sequencing Mutation stop WDR73 c.129T>G [p.Tyr43*] État homozygote

4 Phénotype des patients porteurs de mutations dans le gène wdr73
Séquençage Sanger Recherche de mutations de WDR73 dans une cohorte de 30 patients non apparentés Mutation frameshift homozygote c.766dupC [p.Arg256Profs*18] Phénotype Atteinte neurologique Retard cognitif sévère Microcéphalie secondaire Atrophie cérébelleuse Corps calleux fin Atrophie optique Atteinte rénale Protéinurie SN cortico-résistant Collapsing Sclérose glomérulaire segmentaire et focale (FSGS) Both mutations segregated with the disease and neither is referenced in the Exome variant server database or dbSNP database Renanl involvment: characterized by the diffuse retraction of the glomerular tufts surrounded by hypertrophic podocytes and the focal development of segmental sclerotic lesions. Foci of interstitial fibrosis and tubular dilations were associated with glomerular lesions. Individual II-4 from family A had no proteinuria and had normal renal function at the last follow-up examination at the age of 7 years.

5 Protéine WDR73 WDR exons code pour une protéine contenant 6 domaines WD40 Fonction inconnue Exprimée de façon ubiquitaire dans les tissus humains Domaine WD40 4 pales de brins β antiparallèles Protéine WD40 assemblage des domaines en une hélice à 7 pales We can therefore hypothesize that WDR73 requires the association of another partner to form a complete standard propeller. WDR73 mutations, leading to the deletion of WD40 repeats, might prevent the assembly of this b propeller structure, thus impairing the recruitment of its partners. Migliori et al. 2012 Xu et al. 2011 Schuster-Böckler et al. 2004 WDSP website

6 Localisation de WDR73 dans le rein et le cerveau humain
Immunofluorescence dans des sections de rein humain normal Coloration forte dans les podocytes immatures Décroissance au long de la maturation glomérulaire WDR73 est probablement présent dans le corps cellulaire des podocytes matures Système nerveux central Coloration en immunohistochimie dans des sections de cerveau humain normal Dans le cervelet: corps des cellules de Purkinje Dans le cortex cérébral: neurones pyramidaux et leurs axones de projection Dans la matière blanche: corps des astrocytes et les cellules endothéliales des capillaires cérébraux In fetal kidney, where all stages of nephrogenesis are present Immunofluorescence in normal human kidney sections shows the localization of WDR73 (in green) and synaptopodin (in red). During kidney development, strong labeling of WDR73 was observed from the S-shaped-body stage (white arrow) to the capillary-loop stage (arrow-head) and decreased along glomerulus maturation. Immunoperoxidase staining of endogenous WDR73 in the infant CNS. WDR73 localized to the cell body of Purkinje cells in the cerebellum (left panel, arrows), in pyramidal neurons in the cerebral cortex (middle panel, arrows), and in their projecting axons (left and middle panels, arrow- heads). In the white matter (right panel), WDR73 antibodies stained the cell body of astrocytes (arrows) and their cell processes (black arrowheads) and also endothelial cells of cerebral capillaries (white arrowheads). WDR73 was not detected in oligodendrocytes (red arrowheads). Barre d’échelle 20 μm

7 Localisation Subcellulaire de WDR73 lors du Cycle cellulaire et son Rôle dans la Viabilité cellulaire Fibroblastes contrôles Interphase: coloration diffuse dans le cytoplasme Mitose: accumulation de la coloration au niveau des pôles du fuseau et des microtubules, et plus tard dans le pont de clivage Pattern identique dans les lignées de podocytes humains immortalisées Immunolabeling Barre d’échelle 10 μm

8 Localisation Subcellulaire de WDR73 lors du Cycle cellulaire et son Rôle dans la Viabilité cellulaire Phénotype des podocytes déplétés en WDR73 et des fibroblastes (A-II-4 ) A-Coloration de Hoechst: altérations de la morphologie nucléaire B- Test de prolifération cellulaire colorimétrique (MTT) avec des fibroblastes La viabilité des fibroblastes A-II-4 est significativement plus faible que des fibroblastes contrôles C- Immunomarquage de l’annexine V Taux d’apoptose plus élevé dans les fibroblastes A-II-4 que les fibroblastes contrôles Barre d’échelle 20 μm. (A) Hoechst staining in fibroblasts (left panel) and podocytes (right panel). A-II-4 fibroblasts and WDR73-depleted podocytes displayed alterations in nuclear morphology, including budding, multilobulation (white arrows), shrinkage, or fragmentation. For generating the graphical quantification of the number of nuclear alterations, 100 nuclei from ten random fields in each condition were observed and classified as having either a normal or an abnormal nuclear shape. The Student’s t test was used for comparing differences between A-II-4 and control fibroblasts. The mean 5 SEM is shown (*p < 0.05; **p < 0.01). Scale bars represent 20 mm. (B) Graph showing the results of the colorimetric cell-proliferation assay (MTT) in fibroblasts. The viability of A-II-4 cells was significantly lower than that of control cells. The Student’s t test was used for comparing differences between A-II-4 and control fibroblasts. The mean 5 SEM is shown (*p < 0.05; **p < 0.01). (C) Immunolabeling of annexin V shows a higher rate of apoptosis in A-II-4 fibroblasts than in control fibroblasts. Scale bars repre- sent 10 mm. Barre d’échelle 10 μm. *p < 0.05; **p < 0.01

9 Rôle de WDR73 dans l’Organisation du réseau des Microtubules
Effet de la déplétion de WDR73 sur la polymérisation des microtubules et l’architecture nucléaire dans des podocytes indifférenciés Dépolymérisation des microtubules avec du nocodazole Après la dépolymérisation des microtubules - agrégats de microtubules dans le cytosol - forme similaire du noyau Après la repolymérisation des microtubules - répartition non homogène des microtubules - noyaux multilobulés Nombre de cellules multilobulées pendant le test α-tubuline Immmunolabeling of a-tubulin (in green) and lamin (in red), a marker of the nuclear envelope, before and after nocodazole treatment. After microtubule depolymerization induced by 4 hr incubation with nocodazole (T0), the shape of the nucleus in WDR73-depleted cells became similar to that in control cells, and microtubule aggregates within the cytosol were observed (white arrows). After microtubule repolymerization (T60), WDR73-depleted cells contained a nonhomogenous repartition of microtubules cables (arrow head) that did not properly diffuse within the cytosol, and the nucleus became multilobulated. A graph at T0 and T60 shows the number of multilobulated cells during the microtubule-regrowth assay. The Student’s t test was used for comparing differences between WDR73-depleted and control podocytes. The mean 5 SEM is shown (ns, not significant; *p < 0.05; **p < 0.01). Scale bars represent 20 mm. Lamine Barre d’échelle 20 μm. *p < 0.05; **p < 0.01

10 Discussion: atteinte neurologique
WDR73 a un rôle important dans la survie cellulaire Atrophie cérébelleuse et microcéphalie secondaires Taux élevé de cellules apoptotiques Participation à l'organisation de réseaux de microtubules neuronaux et axonaux Polymérisation défectueuse des microtubules Localisation de WDR73 dans une large variété de neurones et leurs axones de projection Crucial pour le développement cérébral Nos études sur différents modèle cellulaires suggèrent que WDR73 est impliqué dans la survie cellulaire et dans la régulation des micotubules Lewis et al. 2013 Friede 1973

11 Discussion: atteinte rénale
Rôle dans l’organisation du réseau des microtubules Conforme aux données récentes concernant le syndrome néphrotique héréditaire et FSGS = l’intégrité du diaphragme de filtration dépend des microtubules Podocytes = forme de pieuvre Processus primaires enrichis en microtubules Processus secondaires enrichis en actine WDR73 est localisé préférentiellement dans les processus primaires enrichis en microtubules These genes mainly encode slit-diaphragm components and actin-cytoskeleton regulators that confer to the podocyte its precise shape and plasticity. Akchurin et al. 2014 Boyer et al. 2011 Huynh Cong et al. 2014

12 Discussion: neurones et podocytes
Cellules hautement différenciées Différents en terme de structure et de fonction De nombreuses caractéristiques biologiques communes Projections multiples Axones et dendrites dans les neurones Processus primaires et secondaires dans les podocytes Même polarité atypique des micotubules Partagent des protéines de fonction Synaptopodine Huntingtin-interacting protein 1 Neurofascine Olfactomedin-like 2a Présence de vésicules synaptiques neurone-like dans les 2 cellules Sistani, L et al. 2013 Mundel, P et al. 1997 Rastaldi, M.P. et al 2006

13 Discussion: et après? Rôle de WDR73 dans la neurogénèse cérébelleuse
control wdr73 MO 2 dpf Déficit de progéniteurs au niveau du mésencéphale revealed a modest amino acid sequence identity of 39% and sequence similarity of 55%, with an overall conservation of protein length and WD repeat domain organisation Mutation stop ARN WDR73, plus exprimé au 2e jour postfertilisation au niveau du mésencéphalet et rhombencéphale Fgf8 marque les progéniteurs entre le mésencéphale et le rhombencéphale dmbx1a= progéniteurs du mésencéphale -> déficit de progéniteurs au niveau du mésencéphale et présumé cervelet En regardant les progéniteurs mitotiques (marquage pH3) est moindre chez les KO au 1 dpf Moins de progéniteur en prolifération 1dpf, et ils restent dans un état anormal de prolifération 2dpf Progéniteurs mitotiques (pH3) moindre chez les KO à 1 dpf Ils restent dans un état anormal de prolifération 2dpf

14 Discussion: et après? CAD est responsable de la synthèse de novo de la
R N Jinks et al. Brain, june 2015 Tableau = 27 patients confirmés et 3 supposés Mutation frameshift Interaction avec CAD retrouvée en faisant de la coimmunoprésipitation pui spectro de masse sur les bandes. Slow proliferation of NCS fibroblasts might also reflect dysfunction of the mTORC1 signalling pathway CAD is responsible for de novo pyrimidine synthesis during S-phase (Ben-Sahra et al., 2013; Robitaille et al., 2013). Knockdown of Wdr73 in mouse neural progenitor cells resulted in decreased phosphorylation of ribosomal protein S6 (the p70 S6 kinase substrate) Moreover, inactivation of mTORC1 signalling in Rptor knockout mice results in microcephaly associated with reduced neural progenitor cell proliferation, slowing of neural progenitor cell cycle, and increased neuroblast apoptosis, as well as proteinuria and progressive glomerulosclerosis (Godel et al., 2011; Cloetta et al., 2013) CAD est responsable de la synthèse de novo de la pyrimidine au cours de la phase S L’inactivation de mTORC1 (souris RAbKO) - Microcéphalie  de la prolifération des progénieurs ralentissement du cycle cellulaire  apoptose des neuroblastes - Protéinurie et glomérulosclérose progressive Ben-Sahra et al., 2013 Robitaille et al., 2013

15 Discussion: et après? Cohorte: 110 patients 40 familles GMS -> 5%
J Vodopiutz et al. Human mutation, june 2015 CA cerebellar atophy, famille 2: famille CAMOS et 5, pas la mutation dans SCAR5 retrouvée dans la famille 5 Mutations toujours homozygotes, 1 frameshift, 1 stop et 3 faux sens considérées comme délétères N-term: domaine helix-hairpin-helix: HhH domain facilite la liaison à des séquences d’ADN non spécifiques compatible avec la localisation nucléaire de WDR73 pdt le cycle cellulaire et sa fonction supposée dans la polymérisation des microtubules Cohorte: 110 patients 40 familles GMS -> 5% 51 familles CA -> 5,9% Plus large spectre phénotypique CAMOS/SCAR5 N-term: domaine helix-hairpin-helix

16 Take home message HhH

17 Conclusion WDR73 est le premier gène impliqué dans le GMS
WDR73 joue un rôle crucial dans le développement et la maturation du système nerveux la maintenance de la fonction et l’intégrité de la filtration glomérulaire Prospectives Recherche de mutations de WDR73 dans une cohorte de patients atteints d’hypoplasie cérébelleuse Identification de protéines interagissant avec WDR73 Identification de mutations dans d’autres gènes associés avec GMS

18 Remerciements Aux familles Equipe UMR INSERM 1083 – CNRS 6214
Pr Dominique Bonneau Service de Génétique CHU d’Angers Equipe Néphropathies héréditaires et rein en développement de Necker (Inserm/Université U 983) Pr Corinne Antignac Mr Daniel Henrion Pr Pascal Reynier Pr Vincent Procaccio Dr Patrizia Bonneau Arnaud Chrevollier Valérie Desquiret Naïg Gueguen Marc Ferré Jennifer Alban Amélie Goislard Géraldine Leman Selma Kene Stéphanie Chupin Evelyne Huynh-Cong Géraldine Mallet Fabien Nevo Christelle Arrondel Olivier Gribouval Dr Olivia Boyer Dr Marie-Claire Gubler Service de Génétique et de Pédiatrie CHU de Marseille Pr Anne Moncla Pr Michel Tsimaratos Pr Brigitte Chabrol Service d’anatomopathologie CHU de Marseille Dr Laurent Daniel Dr Agnès Guichet Philippe Bonneau Sylvie Rethore Patricia Avillon Martine Pesme Marie-France Senechaud Département de Biochimie et Génétique CHU Limoges Pr Benoit Funalot Laurence Richard Département de Génétique Hôpital Robert Debré Service de Néphropédiatrie Kocaeli Turquie Pr Alain Verloes Dr Zelal Ekinci