IMMUNOLOGIE titre.

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1 IMMUNOLOGIE titre

2 plan 4.1 4. Anticorps: outil d’analyse. * 4.1. Immuno-précipitation.
* Complexe immun et précipitation. Précipitation en milieu liquide * Centrifugation. plan 4.1 Ring test. Néphélométrie. Précipitation en milieu gélifié. * Principe. * Diffusion simple: Mancini. * Diffusion double: Outcherlony. Immuno-électrophorèse. * - simple * - Electrosynérèse * - Electrophorèse en fusée. * Précipitation provoquée.

3 4.1.1 AC libres AC non saturés AC saturés * 4.1. Immuno-précipitation.
Complexe immun et précipitation. 4.1.1 Formation d’un réseau Précipitation PLAN

4 4.1.2.1 centri Ag 4.1.2. Précipitation en milieu liquide AC
Tampon Précipitation en milieu liquide * Centrifugation. centri centrifugation Excès AC Excès Ag culot Ag/AC

5 4.1.2.1 centri suite 4.1.2. Précipitation en milieu liquide PLAN
* Centrifugation. PLAN masse culot zone d’équivalence centri suite qt d’Ag courbe « lapin » masse culôt zone d’équivalence courbe « cheval » qt d’Ag

6 4.1.3.1 principe gel 4.1.3. Précipitation en milieu gélifié.
gradient de [ Ag ] gradient de [ AC ] PLAN

7 4.1.3.2 Mancini PLAN Immunodiffusion radiale simple D2 D2 = a . C + b
AC coulé dans le gel puits creusés dans le gel remplis d’Ag (C variables) Diffusion de l’Ag -----> précipitation au point d’équivalence D2 * Diffusion simple: Mancini. D2 = a . C + b C Ag

8 4.1.3.3 Outcherlony PLAN Immunodiffusion radiale double
identité -----> arcs se prolongent préparer le gel Diffusion creuser les puits verser Ag AC Formation d’un arc de précipitation dans le zone d’équivalence Outcherlony pas d’identité -----> arcs se coupent * Diffusion double: Outcherlony. identité partielle PLAN

9 4.1.3.4 immuno-électr PLAN 4.1.3.4. Immuno-électrophorèse. * - simple
Formation des arcs de précipitation Creuser une gouttière Verser l’AC Laisser diffuser (24 h) Appliquer le champ électrique -----> séparation des Ag Préparer la lame Creuser les puits Les remplir d’Ag immuno-électr Immuno-électrophorèse. * - simple PLAN

10 4.1.3.4 Electrosynérèse - fusées
PLAN Electrosynérèse Electrosynérèse Electrosynérèse - fusées Electrophorèse en fusée Electrophorèse en fusée Immuno-électrophorèse.

11 On utilise des réactifs qui provoquent la précipitation.
PLAN Méthode mise au point dans le cas de complexes ne donnant pas de réseau (pas de précipitation). On utilise des réactifs qui provoquent la précipitation. 4.1.4 préc prov polyéthylène glycol (PEG) = précipitation Ag-AC charbon actif ("dextran-coated charcoal") = précipitation Ag libre Le dextran est un polymère de sucre qui entoure le charbon et évite que les grosses protéines (et AC) soient adsorbées Cette méthode n’est valable uniquement sur les petites molécules (Haptènes, hormones stéroïdiennes,...) Ce dosage peut-être quantitatif grâce à l’utilisation de traceurs (molécules marquées par radioactivité par exemple) * Précipitation provoquée.

12 plan 4.2 4. Anticorps: outil d’analyse.
* Méthodes immuno-enzymatiques. * Principe. * Méthodes qualitatives. Méthodes quantitatives. plan 4.2 * Techniques. Méthodes directe . * ELISA direct (phase hétérogène) * ELISA sandwich (phase hétérogène) * ELISA double sandwich (phase hétérogène) * Dosage d’un AC. Méthodes avec compétition. * EIMA (phase homogène + hétérogène) * EMIT Un exemple de calcul avec ELISA. PLAN

13 4.2.1 principe 4. Anticorps: outil d’analyse.
* Méthodes immuno-enzymatiques. * Principe. Ces méthodes permettent de mettre en évidence la présence d’un complexe Ag-AC grâce à une réaction colorée produite par une enzyme couplée à l’anticorps. 4.2.1 principe Ag Substrat chromogène Enzyme

14 4.2.1.1 couplage 4. Anticorps: outil d’analyse.
* Méthodes immuno-enzymatiques. Le couplage consiste à fixer l’enzyme sur l’anticorps ou l’antigène à l’aide de molécules adaptées. * Principe. Il existe plusieurs techniques pour coupler l’enzyme à l’anticorps. couplage Couplage directe utilisation d’un réactif bi-fonctionnel glutaraldéhyde CHO - (CH2)3 – CHO (liaison covalente entre 2 amines) Prot-N ----(glutaraldéhyde)------N – Ez utilisation de 2 molécules présentant une affinité l'une pour l'autre Couplage indirecte système biotine - avidine Prot - biotine avidine - Ez

15 Quelques réactions enzymatiques sont particulièrement utilisées.
Enzymes Substrats Produits Phosphatase alcaline PNPP (4 nitrophényl Phosphate) Incolore PNP (4 nitrophénol) jaune Peroxydase H2O2 + OPD (orthophénylène diamine) H2O2 + luminol Pdt coloré Pdt luminescent b-galactosidase ONPG (2 nitrophényl b galactoside) ONP G6P déshydrogénase G6P + NAD+ (ou NADP+) NADH (ou NADPH) 340 nm réact util C’est de quelle couleur? U.V. PLAN

16 4.2.2 in situ PLAN Cytologie Biochimie * 4.2.2. Méthodes qualitatives.
Mise en évidence d’Ag spécifiques sur une coupe tissulaire. Mise en évidence d’Ag après séparation par électrophorèse. 4.2.2 in situ Mise en évidence de la kératine du cytosquelette Révélation d’un Western blot par chimioluminiscence

17 Pour qu’un dosage soit quantitatif, il doit être étalonner
Pour qu’un dosage soit quantitatif, il doit être étalonner. Ils nécessitent la préparation d’une gamme de produit à doser. ces techniques sont le plus souvent effectuer dans les puits d’une microplaque. Méthodes quantitatives. * Techniques. techn base On verse, dans les séries de puits, des dilutions croissantes des solutions à doser.

18 4.2.2.1 techn base 2 4.2.3. Méthodes quantitatives.
* Techniques. EMIT montrera le contraire ! Enfin, en principe. La concentration en Ag est inversement «proportionnelle » à la coloration. On distingue deux grands types d’immuno-dosages La concentration en Ag est «proportionnelle » à la coloration. Méthode avec AC en excès Méthode directe Méthode avec AC en concentration limitante Méthode indirecte techn base 2 Méthode directe Méthode indirecte La totalité de l’antigène à doser se lie à l’anticorps. L’antigène à doser est en excès. Abs [Ag] Abs [Ag] Dans ce cas on utilise un traceur qui entre en compétition avec l’antigène. Ce traceur peut être un atome radioactif, une enzyme, un fluorochrome, ou autre...

19 4.2.2.1 techn base 3 4.2.3. Méthodes quantitatives.
* Techniques. Il existe un autre critère de classification. phase homogène phase hétérogène techn base 3 AC et Ag sont mélangés dans une même solution. Les AC sont fixés sur un support (bille, paroi d’un puits,...) On mélange phase homogène / hétérogène avec méthode directe / indirecte (compétition). Utilisation de techniques de séparation (centrifugation,...) pour doser séparément complexe immun et ligand libre. La séparation consiste en un simple "lavage" pour éliminer les ligands libres avant le dosage. Pour que l’exposé soit plus clair, voici un exemple de phase homogène. La phase hétérogène sera abondamment illustrée avec l’étude des principales techniques.

20 4.2.2.1 techn base homog 4.2.3. Méthodes quantitatives.
* Techniques. Il existe autant de méthodes que de techniques de séparation. Il s’agit de séparer le traceur libre du lié. On retrouve le principe des dosages par Scatchard. techn base homog centrifugation + PEG Ces techniques sont adaptées aux petites molécules. Elles ne s’appliquent pas aux protéines de taille moyenne. incubation Un exemple de phase homogène. La phase hétérogène sera abondamment illustrée avec l’étude des principales techniques. centrifugation + charbon actif

21 Dosages indirectes (avec compétition)
PLAN Méthodes quantitatives. * Techniques. Pour finir avec les généralités, voici un résumé des différentes techniques de dosages immunologiques. Traceur Dosages directes AC en excès Dosages indirectes (avec compétition) AC limitant Radiomarqué Immunoradiometric assay IRMA Radioimmuno assay RIA Enzyme Enzyme-labeled immunosorbent assay ELISA Enzymoimmuno assay EIA Fluorescent Immunofluometric assay IFMA Fluoroimmuno assay FIA Luminiscent Immuno luminmetric assay IFLA Luminoimmuno assay LIA nom techn

22 4.2.3.2 ELISA direct ELISA direct. 4.2.3.2. Méthodes directe .
On fixe l’Ag sur les paroi d’un puits. En fait, on prépare une gamme d’Ag dans une boîte. On ajoute les AC en excès. ELISA direct Méthodes directe . lavage Révélation (addition du substrat de l’enzyme). L’intensité de coloration est proportionnelle à la quantité d’Ag. Il existe une variante avec un AC secondaire. (Attention, ce n’est pas la technique en sandwich).

23 4.2.3.2 ELISA direct calculs * 4.2.3. Méthodes quantitatives.
Méthodes directes. ELISA direct. Les calculs: cas 1. Elle est préparée par dilution sériée (généralement d’ordre 2) dans les puits d’une microplaque. La gamme. Abs [Ag] ELISA direct calculs On effectue le même dosage avec l’inconnu. Si l’on obtient une droite, on utilise l’équation de celle-ci.

24 4.2.3.4 calcul pas de lect * 4.2.3. Méthodes quantitatives.
On ne dispose pas d’un lecteur de plaque. Méthodes directes . calcul pas de lect ELISA direct. Les calculs: cas 2. On prépare une gamme de dilutions de l’essai. On compare avec le standard. Ce sera plus clair avec un schéma.

25 4.2.3.4 calculs * 4.2.3. Méthodes quantitatives. = 600 UI
Méthodes directes . Etalonnage Dilution sériée d'ordre 2 témoins 1/D calculs Etalon 150 UI échantillon Céch = 1,17 x 512 = 600 UI limite de sensibilité On en déduit que les derniers puits positifs sont à 1,17 UI dilution limite C = 150 / 128 = 1,17 UI

26 4.2.3.4 calculs lect * 4.2.3. Méthodes quantitatives. ELISA direct.
On dispose d’un lecteur de plaque. Méthodes directes . ELISA direct. Les calculs: cas 3. On mesure l’absorbance de tous les puits. La décroissance de la coloration dépend de la concentration initiale en Ag. On mesure l’absorbance de l’étalon. On mesure l’absorbance de l’échantillon. calculs lect Cét / Céch = aét / aéch Céch = Cét x aéch / aét Céch = 985 x 0,261 / 1,474 = 140 u Abs Cstd = 985 u On compare les pentes. [Ag] en UI

27 4.2.3.2 ELISA sandwich * 4.2.3. Méthodes quantitatives.
Méthodes directe . On ajoute l’Ag. ELISA sandwich. Phase hétérogène. lavage Cette fois ci, ce sont les AC qui sont fixés sur la paroi. On révèle grâce à un AC couplé à l’enzyme. ELISA sandwich lavage Addition du substrat.

28 4.2.3.2 ELISA dble sandwich * 4.2.3. Méthodes quantitatives.
Méthodes directe . On ajoute l’Ag. ELISA double sandwich. lavage On utilise un AC secondaire On ajoute un AC primaire. lavage ELISA dble sandwich On ajoute un AC secondaire couplé à l’enzyme On révèle en ajoutant le substrat. L’intérêt de cette variante est double: Disposer d’un AC polyvalent (il est spécifique du Fc commun à de nombreux AC).

29 4.2.3.2 dos AC * 4.2.3. Méthodes quantitatives. Dosage d’un AC. PLAN
Méthodes directe . On fixe l’Ag sur les paroi d’un puits. Dosage d’un AC. On ajoute les AC à doser lavage dos AC On ajoute l’AC portant l’enzyme. lavage On révèle en ajoutant le substrat. PLAN

30 4.2.3.3 IEMA * 4.2.3. Méthodes quantitatives. IEMA.
Phase homogène Méthodes indirectes. On incube l’Ag avec l’AC fixé sur l’enzyme. IEMA. Abs [Ag] Méthode originale par compétition. Phase hétérogène IEMA On verse le tout dans un puits avec des Ag fixés. lavage On révèle en ajoutant le substrat. Plus les Ag sont nombreux au départ , plus ils mobilisent d’AC, moins la couleur est importante !

31 4.2.3.4 calculs lect * 4.2.3. Méthodes quantitatives.
On dispose d’un lecteur de plaque. Méthodes indirectes . On mesure l’absorbance de tous les puits. La décroissance de la coloration dépend de la concentration initiale en Ag. On mesure l’absorbance de l’étalon. On mesure l’absorbance de l’échantillon. calculs lect Cét / Céch = aét / aéch Céch = Cét x aéch / aét Abs Céch = 150 x 0,048 / 0,012 = 600 UI On compare les pentes. [Ag] en UI

32 4.2.3.3 ELISA comp * 4.2.1. Principe. ELISA compétition.
Phase hétérogène Méthodes indirectes. On verse l’Ag dans un puits où sont fixés les AC. ELISA compétition. On utilise un Ag sur lequel est fixé l’enzyme de révélation. lavage On révèle en ajoutant le substrat. Il existe une variante pour doser un AC. L’Ag est sur le puits et l’AC porte l’enzyme. ELISA comp Abs [Ag] Plus les Ag sont nombreux au départ , plus ils mobilisent d’AC, moins la couleur est importante !

33 4.2.3.3 EMIT * 4.2.3. Méthodes quantitatives. EMIT.
Méthodes indirecte . EMIT. Il s’agit d’une compétition entre un Ag et un haptène conjugué à différents éléments révélateurs. haptène conjugué à une enzyme. haptène conjugué au substrat d’une enzyme. EMIT Il existe 3 versions de ce dosage. haptène conjugué à un inhibiteur d’une enzyme. Ce dosage se déroule en phase homogène et ne nécessite pas de lavage.

34 4.2.3.3 EMIT Ez * 4.2.1. Principe. EMIT. 4.2.3.3. Méthodes indirecte .
On incube un mélange AC, Ag et haptène-Ez La fixation de l’AC sur l’haptène provoque une inhibition stérique de l’enzyme. haptène conjugué à une enzyme. On révèle en ajoutant le substrat. EMIT Ez Abs [Ag] Plus les Ag sont nombreux au départ , plus ils mobilisent d’AC, moins d’haptène sont fixés, plus la couleur est intense !

35 4.2.3.3 EMIT S * 4.2.1. Principe. S EMIT. S S S
haptène conjugué au substrat d’une enzyme. S Méthodes indirecte . EMIT. On incube un mélange AC, Ag et haptène-S La fixation de l’AC sur l’haptène provoque une inhibition stérique de l’enzyme. La fixation de l’AC sur l’haptène provoque un encombrement stérique autour du substrat qui empêche l’action de l’enzyme. On révèle en ajoutant l’enzyme. EMIT S Abs [Ag] S S S Plus les Ag sont nombreux au départ , plus ils mobilisent d’AC, moins d’haptène sont fixés, moins de substrat est neutralisé, plus la couleur est intense !

36 4.2.3.3 EMIT I * 4.2.3. Méthodes quantitatives. I EMIT. I I I PLAN
haptène conjugué à l’inhibiteur d’une enzyme. I Méthodes indirecte . EMIT. On incube un mélange AC, Ag et haptène-I La fixation de l’AC sur l’haptène provoque une inhibition stérique de l’enzyme. La fixation de l’AC sur l’haptène provoque un encombrement stérique autour de l’inhibiteur qui ne peut bloquer l’enzyme. On révèle en ajoutant l’enzyme. EMIT I Abs [Ag] I I I Plus les Ag sont nombreux au départ , plus ils mobilisent d’AC, moins d’haptène sont fixés, moins d’inhibiteur est neutralisé, moins la couleur est intense ! PLAN

37 Il existe plusieurs types de calculs en fonction de la situation.
On ne dispose pas d’un lecteur de plaque. Il existe plusieurs types de calculs en fonction de la situation. On dispose d’un lecteur de plaque. Un exemple de calcul avec ELISA.

38 plan 4.3 4. Anticorps: outil d’analyse. 4.3. Production d’anticorps.
Anticorps polyclonaux. * Immunisation. plan 4.3 * Purification. * Anticorps monoclonaux.

39 les anticorps sont produits par l’organisme à la suite d’un contact avec un antigène.
On parle d’immunisation. * Immunisation. Choix de l’animal. imm Quantité de sérum produit: Le plus gros possible. Coût de revient (installation et entretient) et quantité d’Ag disponible. Le plus petit possible. Le lapin est un bon compromis. Choix phylogénétique Le receveur doit être le plus éloigné possible de l’espèce donneuse. protéine rat -----> cheval ou chèvre

40 4.3.1.1 imm 2 * 4.3.1.1. Immunisation. Technique d’immunisation.
Injecter l’Ag pour qu’il reste le plus longtemps possible dans la circulation sanguine. Injections répétées (rappels). Ralentir la libération par un adjuvant. imm 2 Adjuvant de Freund: - huiles minérales agent émulsionnant particules bacilles tuberculose Douloureux et toxique pour l’animal. L’animal produit de nombreux plasmocytes qui synthétisent de nombreux AC différents. Sérum polyclonal. Sels d’alun Albumine sérique de bœuf méthylé Remarque: les haptènes Les petites molécules sont peu immunogènes. On les complexe à de plus grosses molécules (albumine, hémocyanine d’invertébré): les vecteurs. Nécessité de les purifier !

41 4.3.1.1 imm 2 * 4.3.1.2. Purification. PLAN Technique de purification
Précipitation différentielle Chromatographies diverses d’échange d’ions Chromatographie d’affinité Manip à 4°C Sérum dilué au 1/10 Solution de sulfate d’ammonium ajoutée goutte à goutte sous agitation. 20% solution laiteuse 33% précipitation IgG 40% précipitation Ig (+ contaminant) Centrifugation Culot mis en solution Dialyse contre tampon Ligand = protéines se fixant sur Fc: Prot A Prot G d’origine bactérienne. Protéine se fixant sur ceraines chaînes K Prot L imm 2 échange d’ions exclusion Ligand = Ag Variante Utilisation de billes magnétisées où sont fixés les ligands choisis. ----->plus rapide

42 4.3.2 AC monocl * 4.3.2. Anticorps monoclonaux.
La rate contient de nombreux LyB différents. Principe: Après immunisation on recueille les lymphocytes B de la rate de l’animal. La production d’une grande quantité d’AC passe par la culture « in vitro » des LyB extraits. 4.3.2 AC monocl - Les lyB ne se développent pas sur milieu de culture. - Les souches de myélomes se développent mais ne produisent pas d’AC. * Anticorps monoclonaux. L’idée c’est de fusionner les deux.

43 4.3.2 AC monocl * 4.3.2. Anticorps monoclonaux. Fusion cellulaire.
Mélange de 2 suspensions cellulaires dans 50 mL. - cellules myélome 107 - cellules spléniques 5.107 4.3.2 AC monocl Centrifugation et récupération du culot. 1 200 rpm 5 mn Addition 400 µL PEG goutte à goutte Addition 2 mL milieu sans sérum. Le sérum bloque l’action du PEG. Addition 8 mL milieu avec sérum. Addition 10 mL milieu complet.

44 4.3.2 AC monocl * 4.3.2. Anticorps monoclonaux.
Sélection des hybridomes. La fusion donne 3 types de cellules: Lymphocyte B meurent spontanément en culture Myélome les deux poussent 4.3.2 AC monocl Hybridome Pour séparer les deux, on utilise au départ un mutant de myélome incapable d’utiliser la thymine ou l’hypoxanthine du milieu car dépourvue de la HGPRT: hypoxhanthine-guanine phosphoribosyltransferase. milieu HAT hypoxanthine Aminopterine Thymidine substrat de la voie de sauvetage bloque la voie normale (« de novo ») substrat de la voie de sauvetage Seuls les hybridomes pourvus de la HGPRT se développent.

45 4.3.2 AC monocl * 4.3.2. Anticorps monoclonaux. Screening.
On utilise la technique des dilutions limites. On dilue les suspensions jusqu’à ce que la probabilité que le volume d’inoculation ait peu de chance de contenir deux cellules. Les clones sont répartis dans les puits d’une microplaque puis repiqués dans des tubes ou des boîtes. 4.3.2 AC monocl La nature des AC sécrétés est testée par Western Blot ou ELISA Les AC sélectionnés sont à nouveau testé pour vérifier s’ils induisent des réactions croisées.

46 4.3.2 AC monocl * 4.3.2. Anticorps monoclonaux. FIN de l’immuno
Production des AC. 2 techniques: Injection de l’hybridome à un animal (injection intrapéritonéale). Ponction. Production in vivo. 4.3.2 AC monocl Culture cellulaire. Prélèvement du surnageant. Production in vitro. Purification. Chromatographie (HPLC, affinité). Précipitation à l’ammonium. AC modifiés. Détermination séquence ADN Modification -----> chimères Production Fab