Spectrométrie de masse 2014 Chimie analytique instrumentale 1 Base: les particules individuelles et chargées sont séparées selon les rapports masse- sur-charge.

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1 Spectrométrie de masse 2014 Chimie analytique instrumentale 1 Base: les particules individuelles et chargées sont séparées selon les rapports masse- sur-charge (m/z) (ne pas selon l’énergie) Quels informations?: - masse moléculaire - masse des fragments - mesure de la quantité ABC + e  ABC +● + 2e  AB + + C ● AB ● + C + ACB + ● fragmentation transposition

2 Spectre de masse 2014 Chimie analytique instrumentale 2 Aspirine 180 Pic moléculaire Nombre d’ions Intensité relative Rapportes masse-sur-charge (m/z) 138 43 92 Fragments du molécule Pic moléculaire  calcul de mass moléculaire Pics de fragmentation  reconstitution une partie de la structure Intensité des pics  analyse quantitative 120 Pic de base (le pic plus haut – 100% intensité)

3 Les unités de la masse 2014 Chimie analytique instrumentale 3 La masse c’est soit la masse de une seule particule (atome, molécule, fragment) soit la masse d’un mol (6.023x10 23 ) des particules Masse atomique: donnée en u ou en Da (Dalton) 1u = 1/12 m( 12 C) 12 C = 12.0000 u Masse monoisotopique: ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stable ( 12 C, 1 H, 16 O, 32 S, 14 N,…) Masse moyenne (ou chimique): masse atomique apparaissant sur le tableau périodique  prendre en compte les isotopes et leur abondance Masse relative Mr: masse en relation avec 1/12 de la masse d’un mol de 12 C (sans unités) Masse molaire M: masse moyenne x 6.023x10 23 donnée en g mol  1 John Dalton 1766-1844

4 La masse monoisotopique/moyenne Masse monoisotopique: ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stable ( 12 C, 1 H, 16 O, 32 S, 14 N,…) Masse moyenne (ou chimique): masse atomique apparaissant sur le tableau périodique  prendre en compte les isotopes et leur abondance 2014 Chimie analytique instrumentale 4 Elémentisotope%masse isotopique [u] isotope%masse isotopique [u] isotope%masse isotopique [u] masse moyenne [u] C 12 C98.912.0000 13 C1.113.003312.011 H 1H1H99.9851.0078 2H2H0.0152.01401.0079 N 14 N99.63414.0031 15 N0.36615.000114.0067 O 16 O99.76215.9949 17 O0.03816.9991 18 O0.2017.999215.9994

5 La masse monoisotopique/moyenne Masse monoisotopique: ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stable ( 12 C, 1 H, 16 O, 32 S, 14 N,…)  premier pic du profil isotopique Masse moyenne (ou chimique): masse atomique apparaissant sur le tableau périodique  prendre en compte les isotopes et leur abondance  barycentre du profil isotopique 2014 Chimie analytique instrumentale 5 m/zm/z int. relative masse monoisotopique m/zm/z int. relative masse moyenne

6 Les isotopes 2014 Chimie analytique instrumentale 6 «A-type»: 19 F, 31 P, 127 I ….(éléments pures), H, N, O (< 0.5% abondance) «A+1-type»: 11 B, 12 C…. «A+2-type»: 28 Si, 32 S, 35 Cl, 79 Br…

7 Les isotopes 2014 Chimie analytique instrumentale 7 13 C > 12 C après C 90 Cl n / Br n : motives typiques métaux: souvent des motives typiques

8 Ionisation 2014 Chimie analytique instrumentale 8 Séparation du masse Preuve des ion

9 Le spectromètre de mass Base: les particules individuelles et chargées sont séparées selon les rapports masse-sur-charge (m/z) Opérations nécessaires: a) volatilisation pour séparer les molécules (solution  gaz) b) ionisation pour transformer des molécules on ions  champs électrique dans le spectromètre c) mesure des rapports m/z 2014 Chimie analytique instrumentale 9 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection haut vacuum

10 Le spectromètre de mass Alimentation: rapporter l’échantillon dans le haut vacuum de la machine -via l’état gazeux -via la désorption -via l’aérosol Pourquoi on utilise le haut vacuum? -production des ions isolé dans l’état gazeux -élimination des collision entre les ions ou les ions et autres particules -augmentation de la sensibilité (en air: saturation du détecteur avec les ions d’oxygene ou d’azote) 2014 Chimie analytique instrumentale 10 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection haut vacuum

11 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection Les techniques d’ionisation 2014 Chimie analytique instrumentale 11 haut vacuum ionisationabrév.sourceréaction principaldouce/dure électroniqueEIélectrons thermique M+ e -  M +● + 2e - dure chimiqueCIgaz réactifM+ HX +  MH + + Xassez douce par bombardement d’atomes rapides FABAr, Xe, Cs + M+ X  [M n +H] + M+ X +  [M n +H] + + X assez douce par électro- nébulisation ESIpotentiel électrique élevé M  [M+nH] n+ douce désorption-ionisation laser assistée par matrice MALDIlaser  photonM  [M+nH] n+ douce

12 Ion moléculaire ou pseudo- moléculaire Source d’ionisationPic à rechercher Impact électronique (EI)Ion moléculaire M +● (masse M, charge +1) La plupart des sources p.ex.: Électro-nébulisation (ESI) ionisation chimique (Cl) Ion pseudo-moléculaire p.ex.: Ajout d’un proton sur M: (M+H) + (masse M+1, charge +1) Perte d’un proton de M: (M  H)  (masse M-1, charge -1) 2014 Chimie analytique instrumentale 12

13 Ion moléculaire ou pseudo- moléculaire Source d’ionisationPic à rechercher Impact électronique (EI)Ion moléculaire M +● (masse M, charge +1) La plupart des sources p.ex.: électronébulisation (ESI) ionisation chimique (Cl) Ion pseudo-moléculaire p.ex.: Ajout d’un proton sur M: (M+H) + (masse M+1, charge +1) Perte d’un proton de M: (M  H)  (masse M-1, charge -1) 2014 Chimie analytique instrumentale 13 Le pic à rechercher diffère selon la source d’ionisation ! M +● (M+H) + (M  H)  a) EI b) ESI+ c)ESI- (M+Na) +

14 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection La séparation 2014 Chimie analytique instrumentale 14 haut vacuum Analyseur  mesure de m/z  diffèrent types basés sur des principes physiques différents B:Déflexion par un champ magnétique (plus ancien) Q: Déflexion par un champ quadrupolaire IT:Confinement dans in piège à ion (Ion Trap) TOF:Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR:Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier

15 B:Déflexion par un champ magnétique (plus ancien) 2014 Chimie analytique instrumentale 15 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection haut vacuum La séparation

16 Q: Déflexion par un champ quadrupolaire 2014 Chimie analytique instrumentale 16 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection haut vacuum La séparation

17 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection La séparation 2014 Chimie analytique instrumentale 17 haut vacuum Les ions formés dans la source sont dirigés vers l’analyseur par des champs électrostatiques: - quelques volts (Q, IT, FT-ICR) - plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B)  La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur dépend de l’intensité du champ d’extraction.

18 échantillon Alimentation d’échantillon IonisationSéparationDétection La séparation 2014 Chimie analytique instrumentale 18 haut vacuum Les ions formés dans la source sont dirigés vers l’analyseur par des champs électrostatiques: - quelques volts (Q, IT, FT-ICR) - plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B)  La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur dépend de l’intensité du champ d’extraction. On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents.

19 Résolution 2014 Chimie analytique instrumentale 19 profondeur de la vallée qui sépare les pics à 10%  séparation formule brutemasse exacte m mm résolution 14 N 2 28.0615 0.0303 926 12 C 2 1 H 4 28.0312 12 C 257 1 H 383 14 N 65 16 O 77 32 S 6 5 803.63771.0024 5790 13 C 12 C 256 1 H 383 14 N 65 16 O 77 32 S 6 5 804.6401 insuline MS à basse résolution R ~ 1000-2000 MS à haute résolution R < 150’000

20 Caractéristiques des analyseurs AnalyseurRésolutionGamme m/z Trappe ionique5 0006 000 Quadripôle2 0008 000 Magnétique20 000 Temps de vol20 00050 0000 2014 Chimie analytique instrumentale 20 La résolution R La gamme m/z qu’il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ion le traversent

21 Spectromètres de masse commerciaux 2014 Chimie analytique instrumentale 21  de nombreux couples source / analyseur sont possible

22 Principe de la MS-MS 2014 Chimie analytique instrumentale 22 On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions  étude d’ions fils

23 Principe de la MS-MS 2014 Chimie analytique instrumentale 23 On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions  étude d’ions fils

24 Principe de la MS-MS 2014 Chimie analytique instrumentale 24 On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions  étude d’ions fils Cellule de collision (collision avec hélium) Ses fragments Ion parent

25 Exemple: identification des impuretés 2014 Chimie analytique instrumentale 25

26 2014 Chimie analytique instrumentale 26 EdmannPeptidabbau Der Edman-Abbau erlaubt die Bestimmung der Reihenfolge von Aminosäuren (die Aminosäuresequenz) in einem Peptid durch wiederholte Endgruppenbestimmung. Die Peptidkette wird dabei schrittweise abgebaut. Diese Reaktion wird zur Identifikation der N- terminalen Aminosäure eines Peptids genutzt und besteht aus der Umsetzung eines Peptids mit Phenylisothiocyanat, das auch als Edman- Reagenz bekannt ist.

27 2014 Chimie analytique instrumentale 27 Peptidsequenzierung mittels MS/MS

28 Exemple: «peptide sequencing» 2014 Chimie analytique instrumentale 28

29 SymbolStructureMass (Da) Ala A-NH.CH.(CH 3 ).CO-71.0 Arg R - NH.CH.[(CH 2 ) 3.NH.C(NH).NH 2 ].CO- 156.1 Asn N-NH.CH.(CH 2 CONH 2 ).CO-114.0 Asp D-NH.CH.(CH 2 COOH).CO-115.0 Cys C-NH.CH.(CH 2 SH).CO-103.0 Gln Q-NH.CH.(CH 2 CH 2 CONH 2 ).CO-128.1 Glu E-NH.CH.(CH 2 CH 2 COOH).CO-129.0 Gly G-NH.CH 2.CO-57.0 His H-NH.CH.(CH 2 C 3 H 3 N 2 ).CO-137.1 Ile I-NH.CH.[CH.(CH 3 )CH 2.CH 3 ].CO-113.1 Leu-NH.CH.[CH 2 CH(CH 3 ) 2 ].CO-113.1 Lys K-NH.CH.[(CH 2 ) 4 NH 2 ].CO-128.1 Met M-NH.CH.[(CH 2 ) 2.SCH 3 ].CO-131.0 Phe F-NH.CH.(CH 2 Ph).CO-147.1 Pro P-NH.(CH 2 ) 3.CH.CO-97.1 Ser S-NH.CH.(CH 2 OH).CO-87.0 Thr T-NH.CH.[CH(OH)CH 3 ).CO-101.0 Trp W-NH.CH.[CH 2.C 8 H 6 N].CO-186.1 Tyr Y-NH.CH.[(CH 2 ).C 6 H 4.OH].CO-163.1 Val V-NH.CH.[CH(CH 3 ) 2 ].CO-99.1 2014 Chimie analytique instrumentale 29

30 2014 Chimie analytique instrumentale 30 Bleu: série b Rouge: série y ex. b3-b2 = 391.21 - 262.16 = 129.05  glutamine (E) y4 - y3 = 567.37 - 420.27 = 147.10 Da  phénylalanine (F)  La séquence est NFESGK

31 Couplage avec CPG /HPLC 2014 Chimie analytique instrumentale 31

32 2014 Chimie analytique instrumentale 32 Couplage avec CPG /HPLC