Legionella Legionellose.

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1 Legionella Legionellose

2 Legionella, une bactérie pathogène émergente
Philadelphie juillet 1976, 1e épidémie de pneumonies due à Legionella pneumophila (56th annual American Legion Convention) /180 décès = Maladie des Légionnaires. Janvier 1977, bacille à gram-négatif identifié et nommé L. pneumophila. La source de contamination était le système d ’air conditionné de l’hôtel. Ultérieurement le point essentiel de la maladie des Légionnaires a été la découverte des propriétés de réplication intracellulaire de L. pneumophila dans les macrophages alvéolaires.

3 ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE DE LEGIONELLA
Legionella est retrouvée de manière ubiquitaire dans l ’eau et isolée à partir de nombreuses autres sources environnementales. Bactérie hydrotellurique( eau douce, terre humide, composts…)In vitro exigeante( milieux et durée d’incubation) Multiplication dans les protozoaires libres (amibes)avec lesquels elle vit en symbiose. Température optimale de multiplication entre 25 et 45°C Réservoirs artificiels:ECS (collectivités, hôtels…), climatisation humide, TAR,thermes, saunas, bains à remous, fontaines, nébuliseurs, respirateurs, humidificateurs, brumisateurs…

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5 Sources artificielles

6 EPIDEMIOLOGIE DE LEGIONELLA incidence de la maladie
0.5 à 5% des pneumopathies communautaires Sporadiques ou cas groupés(au moins 2 cas en moins de 6 mois) Cas groupés :épidémies hôpitaux, hôtels, grands immeubles, émissions extérieures (TAR) Fréquence saisonnière : pic été/automne Maladie à déclaration obligatoire(1987) Détection précoce des épidémies Suivi de l’évolution de l’incidence INVS :1.9 cas / habitants 20% origine nosocomiale Lp 95% des cas , 80% Lp1 Fièvre de Pontiac:Lp 1,6,7, anisa Toutes les espèces sont potentiellement pathogènes

7 Modes de transmission Voie aérienne :Inhalation seule voie démontrée
Contamination par ingestion Discutée en cas de fausse route Pas de contamination interhumaine Pas de contamination manuportée Pas d’isolement septique de patient atteint

8 Facteurs de risque individuels
intrinsèques âge > 50 ans - sexe masculin Tabagisme - éthylisme Traitements immunosuppresseurs - maladie sous jacente(diabète, cancer, cardiopathie, affections respiratoires ) extrinsèques Exposition +/- prolongée ou fréquente État du réseau et entretien (détartrage des pommeaux de douche, robinets..) Aérosols, ventilation à domicile

9 Facteurs de risque collectifs
Hôpitaux, hôtels, campings, stations thermales, centres de loisirs… Tours aéro-réfrigérantes( émission de nuages contaminés à plusieurs kilomètres) cf circulaires et arrêtés

10 La bactérie Eubactérie, legionellaceae, espèce Legionella, espèce type Legionella pneumophila sous espèces: Lp subsp pneumophila: Philadelphia 1 et sérogroupes 2-15 Lp subsp fraseri : Los angeles 1(sérogroupe Lp4) Sérogroupes 1,4,5 et Lansing 3 Lp subsp pascullei sérogroupe 5 (type U8W) Les « Legionella-like-amoebal-pathogens » LLAPs intracellulaires obligatoires, différentes espèces dans le genre Legionella

11 Legionella, bactérie à multiplication intra-cellulaire.
En 1980, Rowbotham a décrit la capacité de L. pneumophila à se multiplier dans les amibes (protozoaires). Le mécanisme de réplication intracellulaire de L. pneumophila dans les phagosomes des cellules de mammifères et des protozoaires est identique. Il n ’y a pas de fusion du phagosome avec les lysosomes Une association est réalisée avec le réticulum endoplasmique (présence de protéine chaperonne spécifique du RE, la protéine Bip). Au moins 16 gènes sont impliqués dans ce mécanisme (dotA…).

12 Infection par LP1 à 4 et 12h: A, B H.vermiformis C, D WI-26 humain

13 Diagnostic biologique
Anomalies non spécifiques Hyperleucocytose formule inversée (parfois leucopénie et thrombopénie) Atteinte rénale:protéinurie -hématurie-hyponatrémie – hypophosphatémie Atteinte hépatique : augmentation de aspartate amino-transférase, PAL, LDH Atteinte pulmonaire :hypoxémie

14 Diagnostic bactériologique
Direct I.F directe sur le prélèvement Culture Antigène urinaire PCR Indirect Sérodiagnostic

15 Immunofluorescence directe
Rapide ( 2 heures) par AC poly et monoclonaux tous les sérogroupes de Lp Peu sensible(25-40%) seuil de détection 104 UFC/ml Peu spécifique(60-70%) Réactions croisées Lecteur dépendant

16 Antigènes solubles urinaires
Précoce 1 à 3 jours Persistance 45 jours ELISA Immunochromatographie Sensibilité 56 à 80% Spécificité 99% Legionella pneumophila 1, 3, 6 selon réactif Valeur prédictive négative 95% Valeur prédictive positive 86%

17 Cultures Méthode de référence certitude, spécificité100%, sensibilité 40 à 60% Aérobie stricte CO2 (2.5%) primo isolement PH tolère pH 5.5 Température 35°C Exigence en cystéine milieu BCYE cultive en jours(absence de culture sur gélose sang –croissance possible en absence de cystéine par adaptation) Milieu sélectif avec antibiotiques (céphalotine, colimycine, vancomycine) inhibiteur pour certaines souches

18 2 1 3 1-2-3-Legionella pneumophila 4-legionalla anisa Milieu BCYE 4

19 Examen direct Coloration de Gram peu ou pas visible non capsulé non sporulé 2 à 20µm / 0.3 à 0.9µm Prélèvement court fin et coccobacillaire Bacille gram négatif long et filamenteux en culture

20 Type de prélèvements Nature –qualité Stockage Ensemencement
Respiratoire:LBA - aspirations - expectoration -biopsie pulmonaire -liquide pleural Localisation extra pulmonaire: sang -liquide péricardique endocardite –myocardite -foie- rate –rein -peau Stockage 4°C -si délai> 3 jours congélation – 20°C Ensemencement 100µl de prélèvement en direct ou après traitement sur milieux appropriés les biopsies ou tissus au mortier dans de l’ eau stérile Décontamination En cas de contamination bactérienne importante Acidifier par HCl 0.2M neutraliser par KOH ou NaOH 0.01M En cas d’échec chauffer 30 mn à 50 °C Dilution des échantillons pour diminuer la contamination et l’effet antibiotique

21 Identification et différenciation des Legionella
Morphologie -Caractères culturaux Caractères biochimiques et enzymatiques Caractères antigéniques Méthodes moléculaires Autres méthodes: Composition de la membrane cytoplasmique en ubiquinones par chromatographie liquide Composition de la paroi en acides gras ramifiés par chromatographie gazeuse Co-culture amibienne

22 Morphologie Colonies grises muqueuses polymorphes en verre fritté ( loupe binoculaire 30 fois ) Lumière de Wood à 366 nm fluorescence pour différencier L.P et d’autres espèces: Bleue: L.anisa, bozemanii, dumoffi, gormanii, gratiana, cherrii, parisiensis, stegerwaltii, tucsonensis Rouge : L.rubrilucens, erythra Autres milieux pourpre de bromocrésol, bleu de bromophénol = colonies de couleurs variables Pigments sécrétés « melanin-like » = brunissement du milieu exempt de charbon contenant L- tyrosine ou L- phénylalanine

23 BCYE- LEGIONELLA BOZMANII- UV LEGIONELLA PNEUMOPHILA- LOUPE BINOCULAIRE

24 Caractères culturaux Colonies suspectes repiquées sur 3 milieux: BCYE sans cystéine - Gélose au sang - BCYE: après 48h à 72h d’incubation culture positive sur BCYE Observation à la loupe binoculaire: aspect en verre fritté

25 Caractéres biochimiques
Catalase+ sauf L.worsleinsis Oxydase +/- Hippurate + L.pneumophila Gélatine + sauf micdadei feeleii maceabernii Mobilité + (fagelles polaires ou bipolaires) sauf okbridgensis londiniensis Test à l’amidon +

26 Caractères antigéniques
L.pneumophila : LPS, protéine « MOMP » présente chez tous les sérotypes de Lp et spécifique d’espèce et d’autres antigènes protéiques IFD réactif commercialisé AC monoclonal anti MOMP =différence Lp et Lnp

27 Caractères antigéniques
Agglutination de particules de latex : LP1, et Lnp (7 espèces) Identification finale de 64 sérogroupes : AC de lapin spécifique de chaque espèce et sérogroupe (laboratoires spécialisés)

28 Méthodes moléculaires
PCR RAPD :amplification aléatoire de l’ADN Amplification des espaces intergèniques 16s-23s pour Lnp Séquençage nucléotidique du gène mip, du gène codant pour l’ARN 16s, 5s et espaces intergéniques 16s-23s

29 Amplification génique
Prélèvements Urines, LBA ,sérums Gènes amplifiés Mip (détection de 50 UFC dans LBA) Gène rrf correspondant à ARN5s ribosomal (genre Legionella) ARN16s Avantages: rapidité et détection de toutes les espèces de legionella Critère de définition de cas (en cours de validation)

30 Diagnostic sérologique
Immunofluorescence indirecte ou ELISA ( screening) Séroconversion: tardive apparition lente des anticorps 2 prélèvements ( 4 à 6 semaines d ’intervalle) Persistance des anticorps 3 à 18 mois Sensibilité 75% Spécificité 95% Sérogroupes autres que LP1 (épidémiologie)

31 Tests en pratique de ville
Echec de traitement aux bêta-lactamines à 3 jours => modification,mise en place d’une antibiothérapie active sur germes atypiques. Antigène soluble urinaire LP1 (contexte épidémique ou forte présomption ou échec thérapeutique) Sévérité conduisant à l’hospitalisation

32 Avantages et dangers de l’AG urinaire
Spécificité LP1 (faux négatifs autres LP). Faux positifs exceptionnels(maladie sérique) Impossibilité de confirmer une épidémie par comparaison des souches cliniques et environnementales Très rapide. Systématique à l’hôpital (signes respiratoires survenants en cours d’hospitalisation et absents à l’admission)

33 Critères de définition des cas
Cas confirmé :Pneumopathie et/ou image radiologique associée à une confirmation Isolement de Legionella Immunofluorescence directe positive Présence d ’antigènes solubles urinaires Séroconversion : augmentation du titre AC( 4 fois) Cas possible Pneumopathie et/ou image radiologique associée à Titre unique élevé 256 quelque soit l’espèce Les techniques d’amplification géniques vont être incluses dans les critères de définition des cas

34 Définitions cas groupés
Au moins 2 cas survenus en moins de 6 mois dans un même lieu d’exposition Intervalle de temps > 6 mois= cas liés Cas nosocomial Certain: patient qui a séjourné 10 jours avant le début des signes cliniques Probable: patient qui a séjourné au moins 1 jour pendant les 8 jours précédents les signes cliniques

35 Déclaration DASS CCLIN CNR EWGLI INVS
enquête environnementale du patient CCLIN Cas nosocomial à signaler ( DDASS) CNR envoyer les souches pour enquête épidémiologique et confirmation du sérogroupe et / ou de l ’espèce ( L.P.2-15 et Legionella non pneumophila) étude épidémiologique EWGLI réseau de surveillance européen des légionelloses acquises lors des voyages INVS

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37 CNR-Glossaire Legionella 2007
Souches endémiques Souche Paris(10%) des cas en France diagnostiqués par culture Souche Lorraine(10%) des cas diagnostiqués par culture Souche Mondial(épidémie coupe du monde à Paris 1998) endémique en région parisienne

38 CNR-Glossaire Legionella 2007
Souches épidémiques Souche Montparnasse épidémie Paris été 1999 Souche Rennes épidémie Rennes 2000 Souche Sarlat épidémie Sarlat 2002 Souche Montpellier épidémie Montpellier 2003 Souche Poitiers épidémie Poitiers 2003 Souche Lens épidémie Lens décembre 2003 et janvier 2004 Souche Austerlitz épidémie à Paris en 2006

39 Sensibilité aux antibiotiques traitement
Bêta lactamines: résistance par secretion de bêta –lactamase Macrolides: Erythromycine voie orale pour les formes communes en monothérapie Fluoroquinolones: voie orale pour les formes communes Traitement formes sévères: associationavec rifampicine voie parentérale